论文部分内容阅读
天然产物生物合成途径的阐明，对仿生合成、组合生物合成、基因组挖掘以及高效催化剂的发现发展等方面都具有十分重要的指导意义。尤其是那些重要化合物单元便捷生物合成途径的解析，将有助于发展绿色高效的人工合成途径，比如广泛存在于活性天然产物中的喹啉单元。 硫肽类抗生素（Thiopeptide antibiotics）是一类富含硫元素结构高度修饰的环肽类天然产物，因其复杂的结构、良好的药理活性而备受研究者们的关注。但由于该类抗生素水溶性差等因素，限制了其在临床上的应用，因此，对其生物合成途径进行解析，从而发展更适合临床药用的硫肽类抗生素类似物就越来越受研究者们的重视。其中，含喹萘啶酸(Quinaldic acid，QA)侧环的双环硫肽，在结构的复杂程度和药理活性上都高于单环硫肽，对其相关生物合成途径的解析也就更加迫切。前期研究表明双环硫肽侧环QA部分在该类抗生素药理活性的发挥和改善上都占有十分重要的地位，是由色氨酸经关键的喹啉酮中间体转化而来。该中间体的形成涉及了重要喹啉单元的扩环构筑过程，至今仍未报道。因此，本文选取了极具代表性的硫肽类抗生素—硫链丝菌素(Thiostrepton，TSR)为研究平台，对该过程展开了详细研究。 首先，我们在前期工作的基础上，结合生物信息学分析推测以2-甲基-色氨酸为底物，TSR侧环喹啉单元的形成需要TsrA、TsrE和TsrD三个酶参与，然而随后的生物转化实验结果表明该过程至少也只需要TsrA和TsrE两个酶就可完成。接着，我们通过体外侧活实验确定了TsrA是一个PLP依赖的氨基转移酶，介导可逆的氨基转移反应，可将2-甲基-L-色氨酸转化成2-甲基吲哚-3-丙酮酸;而TsrE是一个全新的还原型黄素(FADH2/FMNH2)和O2依赖的氧化酶，可以高立体选择性的氧化2-甲基吲哚-3-丙酮酸C2-C3位形成(2R，3S)环氧中间体，该中间体十分不稳定，会自发经异构化、水解、缩合、脱水芳构化等过程扩环完成喹啉单元的构筑并伴有副产物的生成。副产物的生成使我们重新关注了生物体中TsrD存在的意义，通过不同温度下对TsrD进行串联测活研究，结合HR-MS/MS检测技术，确认TsrD介导了扩环过程中的水解与缩合过程，在加速扩环反应的同时减少了副产物的生成，而最后一步脱水芳构化是自发完成的。最后，通过对TsrD进行蛋白晶体解析确认其为细胞核转运因子2(Nuclear transport factor2，NTF2 like)似超家族蛋白中的新功能酶，结合蛋白小分子对接与点突变实验确定了TsrD关键的活性位点为Asp105，并对酶学机制做出了推测。由于TsrA、TsrE和TsrD的同源蛋白也存在于其他含QA侧环的硫肽类抗生素生物合成途径中，表明TSR生物合成途径中喹啉单元的形成策略具有普适性。这也是首次详细解析了通过吲哚环N1-C1键断裂构筑喹啉单元的生化反应过程，为其他含有相似构筑途径的活性天然喹啉衍生物的生物合成途径研究以及基因组挖掘提供了一定的指导意义，比如抗疟药奎宁（Quinine）等。 而在解决TSR侧环喹啉单元的形成过程中，我们不仅详细了解了相关酶的催化机制，还发现这些酶具有较好的底物容忍性，因此我们对其展开了应用性研究，并取得了如下的进展: 1）建立了多种喹啉衍生物合成的生物催化途径; 2）建立了TSR侧环喹啉单元的高效修饰途径。 另外，基于TsrE不对氧化特性，以其为催化剂，设计并合成了多种化学不对称催化途径难以获得的立体专一性的3位羟化吲哚类产物，可作为多种活性天然产物类似物的合成前体。另外，我们还发现TsrE可以催化3位无取代基的吲哚类似物形成酮基产物。这些绿色高效的生物催化途径的建立，以及产物的多样性为相关活性天然产物及其类似物的组合生物合成、化学合成和仿生催化剂的发展等都提供了有利的基础。