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由于在前期研究工作中构建的r-sHSA基因工程菌株的表达量较低(占TSP的5.8﹪),分离纯化效率不高,为便于后续的开发,该研究将以pET-28a为表达载体,构建r-sHSA的高效表达基因工程菌株,获得纯化的重组产物,并研究其药效作用及初步探讨药效作用机制.该项目研究完成的工作如下:1)sHSA基因的克隆、结构预测及其产物功能的初步分析;根据前期对sHSS的N-端氨基酸序列的分析结果,设计简并引物,以鲨鱼再生24hr肝脏的总RNA为模板,利用RT-PCR技术获得一段cDNA序列,通过ORF Finder分析软件和Propredict分析软件对其编码产物及其产物的理化性质、二级结构等进行了分析.2)sHSA基因工程菌株的构建及其产物(r-sHSA)的分离纯化;构建了sHSA的原核表达载体pET-sHSA,转化大肠杆菌BL21后获得基因工程菌株;利用1mmol/L的IPTG诱导,考察了不同诱导时间对重组产物表达量的影响,并初步确定了菌株的小试发酵条件,通过在该条件下诱导表达2hr,产物的表达量占菌体可溶性蛋白总量的38﹪,产物主要以包涵体的形式存在于细胞质基质中;利用重组产物融合有一段His·Tag的特性,通过金属鏊合亲和层析和凝血酶酶切的方法初步建立了重组产物的分离纯化工艺并获得了大量的融合蛋白,将复性后的融合蛋白经凝血酶酶切获得r-sHSA,SDS-PAGE分析表明其分子量为17,500Da,与理论值相近,纯度约为94﹪,进一步通过RP-HPLC分析证明其纯度为97.3﹪.3)r-sHSA的生物活性研究;r-sHSA对肿瘤细胞株增殖的影响:实验结果表明,r-sHSA对不同肿瘤细胞株增殖的效果不同,低浓度的r-sHSA(<2.8μmol/L)表现出对肝癌细胞SMMC7721明显的刺激增生作用,与天然sHSS的活性相近;不同浓度的r-sHSA对肺腺癌细胞株A549、人胃癌细胞株BGC和人白血病细胞株HL60等均有一定的抑制作用,其中5.7μmol/L的r-sHSA对上述三种细胞株的抑制率分别达到61.6﹪、51.8﹪和93.2﹪,表现出强烈的抑制肿瘤细胞增殖的效果.4)r-sHSA对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用;利用腹腔注射四氯化碳建立的小鼠化学性肝损伤动物模型,考察了r-sHSA对肝脏的保护作用,发现不同浓度(0.008、0.04、0.2mg/kg)的r-sHSA均具有明显抑制模型小鼠血清转氨酶活性,具有很强的肝保护作用.5)r-sHSA抗肝炎作用机制的初步研究;通过病理切片观察了r-sHSA对受损肝组织的保护作用,与模型组相比,高、中剂量组的r-sHSA均有明显的减轻肝细胞肿胀,减少汇管区中性粒细胞的浸润以及防止肝小叶的破坏作用,低剂量组效果不明显,不同剂量组的重组产物的作用程度与血清转氨酶水平有一定的对应性.