论文部分内容阅读
系统性红斑狼疮(SLE)是一累及全身多系统，多器官的自身免疫性性疾病，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是SLE最常见的临床表现之一，是一种免疫复合物介导的肾小球疾病。狼疮性肾炎的治疗近年已取得了很大进展，糖皮质激素和/或免疫抑制剂及细胞毒性药物仍是LN治疗的首选药物。然而还有很多问题没有解决，终末期肾功能衰竭仍是LN死亡的主要原因之一。另外糖皮质激素和免疫抑制剂及细胞毒性药物的长期应用引起的毒副作用尚有待解决。因此有必要寻求一种新的治疗途径。
大量的研究表明在SLE患者体内无论是B细胞异常引起的体液免疫反应还是T细胞异常引起的细胞免疫反应都与树突状细胞(dendritic cell，DC)的功能改变有直接关系。
DC是一种已知功能最强的专职抗原提呈细胞，研究表明DC是免疫调节网络的核心细胞，除了具有免疫激发功能外，在诱导中枢免疫耐受以及外周免疫耐受的维持和调节也发挥重要作用。研究认为DC的来源、表型、成熟度和功能的异质性是平衡免疫反应和免疫耐受的重要因素。
辅助性T细胞(Th)可分为Th1和Th2细胞，生理条件下，机体的Th1细胞和Th2细胞处于相对平衡状态，一旦这种平衡发生平衡发生偏离，机体就会处于疾病状态。最近的研究表明，Th1/Th2细胞的平衡偏离及细胞因子调节网络异常与SLE的发病及病理损伤密切相关。研究认为辅助性T细胞的分化主要受DC所调控。DC通过其表面分子刺激T细胞活化，通过细胞因子调节Th细胞分化方向。通过调控DC的成熟，进而调节Th1/Th2细胞分化过程和影响它们的效应机制是诱导免疫应答和免疫耐受的关键。
核转录因子(NF-κB)是已知的在炎症和免疫中发挥核心作用的转录因子，被认为是DC发育成熟的关键性调控基因，在哺乳动物中发现有五种NF-κB/REL成员。人类尝试利用RNAi技术减弱NF-κB表达及活性，以期获得致耐受DC。RelB作为NF-KB家族的五个成员之一，是小鼠骨髓DC发育成熟所必需的，因而RelB不失为RNAi作用的一个很好靶标。本实验拟采用利用RNA干扰抑制RELB基因表达来构建耐受性DC应用于治疗狼疮肾炎小鼠。
目的：
1.RNA干扰树突状细胞成熟的免疫耐受作用及机制。
2.观察RNA干扰树突状细胞成熟对狼疮肾炎小鼠的治疗效应，为LN治疗提供新的思路与依据。
材料与方法：
体外培养小鼠骨髓来源DC细胞，于收集前24小时加入LPS(1ug/ml)可得到成熟DC即mDC.收集mDC用Lipofectamine2000介导RNA干扰，实验分为5组：第1组RNAi的阳性对照；第2组RNAi的阴性对照；第3、4、5组分别加入siRNA序列1、siRNA序列2、siRNA序列3。通过半定量RT-PCR检测各组细胞中relB的mRNA含量，Western Blot检测relB蛋白含量。筛选出阻断relB效果最明显的siRNA序列，然后转入体外培养的mDC。与未转染组做对照。光镜电镜检测DC形态检测;流式细胞检测DC表面标志(MHCⅡ、CD80、CD86)；ELISA检测DC分泌细胞因子(IL-12)的改变。
同时制造狼疮肾炎模型.通过检测血清抗ds-DNA抗体，尿蛋白检测，肾组织光电镜观察进行鉴定.
将干扰后的树突状细胞输入狼疮肾炎动物模型中，模型鼠分为3组：空白对照组(尾静脉注射生理盐水)，非干预组(尾静脉注射未处理DC)，干预组(尾静脉注射干扰后DC).检测各组蛋白尿水平、血清抗ds-DNA抗体及肾组织病理改变。
结果:
小鼠骨髓细胞在rmGM-CSF和rmIL-4刺激下培养，随培养时间延长，细胞集落明显增多，到5-7天，可见大量细胞悬浮.经流式检测CD11c阳性率比较高.3个序列siRNA干扰mDC后其中有序列3 siRNA能明显沉默RelB基因。特异位点的RelB siRNA干扰后DC形态近似未成熟DC，MHCⅡ、CD80，CD86水平及细胞因子(IL-12)的分泌显著低于未干扰组.
模型鼠自第4周开始出现尿蛋白升高，抗ds-DNA抗体阳性，肾脏病理表现为肾小球弥漫增生，炎症细胞增多。
siRNA干扰后的耐受性DC输入模型鼠体内后3周尿蛋白排泄减少，抗ds-DNA抗体水平下降，肾脏病理改变减轻。
结论:
1.特异位点的RelB siRNA对小鼠骨髓来源DC有抑制成熟作用：
(1)siRNA干扰后DC形态近似未成熟DC，树突减少；
(2)降低细胞表面MHCⅡ、CD80、CD86水平；
(3)抑制DC分泌IL-12。
2.淋巴细胞输入能诱导小鼠狼疮肾炎样模型：
(1)模型鼠表现为类似狼疮肾炎样症状如脱毛，腹水，消瘦;
(2)模型鼠尿蛋白水平显著增高；
(3)抗ds-DNA抗体阳性；
(4)肾脏病理表现为肾小球弥漫增生，炎症细胞侵润。
3.siRNA干扰后的耐受性DC对模型鼠有一定的治疗作用：
(1)耐受性DC输入狼疮肾炎模型鼠后减少尿蛋白排泄；
(2)降低血清抗ds-DNA水平；
(3)肾脏病理改变减轻。