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目的雌激素受体(estrogen receptor, ER)阳性乳腺癌占所有乳腺癌的70-80%。内分泌治疗(包括抗雌激素制剂他莫昔芬和芳香化酶抑制剂AIs)是ER阳性乳腺癌的标准治疗。但很多患者会在初始(原发性耐药)或内分泌治疗一段时间后(继发性耐药)出现耐药。缺氧是包括乳腺癌在内的实体肿瘤发生发展过程中普遍存在的现象,缺氧诱导因子HIF-1a是缺氧反应的核心因子,研究表明HIF-1α升高与肿瘤局部浸润和转移能力增强、及放化疗不敏感等相关。HIF-1α与乳腺癌内分泌耐药的相关性尚未明确,尤其缺乏直接的体内证据。唑来膦酸是一类含氮双磷酸盐,是目前治疗乳腺癌骨转移的标准药物。有研究表明唑来膦酸具有直接抗肿瘤作用,但其在HIF-1α介导的内分泌耐药中的作用鲜有报道。我们曾经诊治过一例继发性内分泌耐药的老年患者,该患者在新辅助内分泌治疗(来曲唑,2.5mg qd)32个月后发生耐药,耐药后予第二次空心针穿刺,免疫组化提示HIF-1α明显升高,因患者有严重的骨质疏松,故行唑来膦酸治疗一次,手术推迟一月后进行,结果发现手术标本HIF-1α和ki67表达明显降低。目前该患者行依西酶坦联合唑来膦酸治疗,截至本论文书写前,该患者一般情况良好,无复发和转移倾向。因此,我们推测唑来膦酸可能在内分泌耐药中扮演着重要的角色。本研究旨在明确HIF-1α与乳腺癌内分泌耐药的相关性及唑来膦酸在HIF-1α介导的内分泌耐药中的作用及相关机制。方法第一部分1.对经新辅助治疗32个月后出现耐药的患者耐药后及唑来膦酸治疗后石蜡标本进行了免疫组化检测。2.收集2011-2013年间复旦大学附属肿瘤医院行新辅助内分泌治疗的所有患者临床病理资料,新辅助来曲唑治疗疗效评估资料及石蜡标本共20对。2.采用免疫组化方法检测新辅助内分泌治疗前基线、治疗后残余标本中及经唑来膦酸治疗后手术标本HIF-1α表达水平。第二部分1.将HIF-1α基因全长导入人乳腺癌ER-alpha阳性的MCF-7细胞,经筛选后获得HIF-1α稳定表达的细胞株。2.采用CCK-8试剂盒测定并绘制细胞生长曲线及克隆形成实验观察其对内分泌药物氟维司群的敏感性。3.分别建立人乳腺癌MCF-7稳转细胞株和空载细胞株的裸鼠原位移植瘤模型,观察稳转HIF-1α基因细胞株与空载细胞株所成移植瘤在增殖特征上的差异及其对内分泌药物氟维司群的敏感性差异。4.将人乳腺癌ER-alpha阳性的MCF-7细胞在慢性间歇性缺氧环境下长期培养至少三个月,以获得稳定生长的缺氧细胞株。5.采用CCK-8试剂盒测定并绘制细胞生长曲线的方法分别观察缺氧和正常供氧人乳腺癌细胞生物学行为及其对内分泌药物氟维司群处理的敏感性。6.用Western blot方法分别检测野生型人乳腺癌细胞MCF-7在经历慢性间断性乏氧后HIF-1α和ER-alpha表达变化。7.用靶向HIF-1α的shRNA干扰慢性乏氧细胞中的HIF-1α基因,采用克隆形成实验观察其对内分泌药物氟维司群的敏感性变化。8.用Western blot方法分别检测野生型人乳腺癌细胞MCF-7在正常氧和缺氧环境中唑来膦酸对HIF-lalph及耐药相关的各信号通路蛋白表达水平影响,Real-time PCR检测唑来膦酸对HIF-1α mRNA水平影响。9.采用CCK-8试剂盒测定并绘制细胞生长曲线及克隆形成实验分别观察HIF-1α稳转细胞和空载细胞生物学行为及其对氟维司群、唑来膦酸及氟维司群联合唑来膦酸的敏感性。10.分别建立人乳腺癌MCF-7稳转细胞株和空载细胞株的裸鼠原位移植瘤模型,观察HIF-1α稳转细胞株与空载细胞株所形成的移植瘤在增殖特征上的差异及其对内分泌药物氟维司群联合唑来膦酸的敏感性差异。结果第一部分1.该患者第二次空心针穿刺标本中的HIF-1α表达水平明显升高,唑来膦酸治疗后,标本中的HIF-1α表达明显下降。2.基线标本中HIF-1α表达与新辅助内分泌治疗疗效呈负相关(N=20, P=0.002, spearman test)。3.新辅助内分泌联合唑来膦酸治疗后肿瘤组织内的HIF-1-alpha水平无论是仅从阳性细胞着色程度(p=0.003)或总体IHC评分(阳性细胞着色程度+阳性细胞数)(p=0.001)均明显低于第二次空芯针活检(唑来膦酸治疗前)的乳腺癌标本。第二部分1.将HIF-1α基因全长导入至人乳腺癌ER-alpha阳性的MCF-7细胞,经筛选后获得HIF-1α稳定表达的细胞株(MCF-7/hif)。2. MCF-7/hif细胞较空载细胞对内分泌药物氟维司群的敏感性降低(P<0.01)。3.人乳腺癌MCF-7空载细胞株所成移植瘤经过氟维司群药物处理后,与治疗前体积相比其生长速度受到明显抑制,且肿瘤体积明显缩小(P<0.01);然而MCF-7稳转HIF-1α基因细胞株所成移植瘤在经过氟维司群药物处理后,其生长速度和肿瘤体积均与治疗前无明显差异(P>0.05)。4.通过长期(大于3月)慢性间歇性缺氧培养,获得了稳定生长的人乳腺癌MCF-7缺氧细胞株(MCF-7/hyp).5.体外实验中缺氧细胞株MCF-7/hyp生长增殖能力较正常供氧细胞MCF/wt显著增加(P<0.01)。与人乳腺癌正常供氧细胞株MCF-7/wt相比,缺氧细胞株的HIF-1α表达上调,而ER-alpha表达稍有下调。6.将人乳腺癌MCF-7缺氧细胞株中的HIF-1α基因干扰掉后,其对内分泌药物氟维司群的敏感性明显增加(P<0.01)。7. Western-blot结果提示唑来膦酸明显抑制野生型MCF-7细胞在缺氧环境中HIF-1α和RAS蛋白的表达及与耐药相关的信号通路关键蛋白pMAPK和pmTOR的表达(P<0.01),而P13K和pAKT无明显变化(P>0.05)。8.单药唑来膦酸没有抑制MCF-7/hif细胞的增殖(P>0.05),但唑来膦酸联合氟维司群明显抑制了MCF-7/hif细胞的增殖(P<0.01)9.人乳腺癌MCF-7空载细胞株所成移植瘤经过唑来膦酸治疗后,与治疗前体积相比其生长速度受到明显抑制,且肿瘤体积明显缩小(P<0.05);然而MCF-7稳转HIF-1α基因细胞株所成移植瘤在经过唑来膦酸治疗后,其生长速度和肿瘤体积均与治疗前无明显差异(P>0.05),但唑来膦酸联合氟维司群明显抑制其生长,且肿瘤体积明显缩小(P<0.05)。结论缺氧诱导因子HIF-1α在内分泌耐药中起着关键作用,HIF-1α阳性细胞对内分泌治疗不敏感。唑来膦酸可能通过抑制RAS/MAPK/mTOR通路改善内分泌耐药。针对乏氧调节通路中关键调节分子的靶向抑制剂可能是逆转乳腺癌内分泌耐药的有效途径。