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第一章DNA甲基化芯片联合表达谱芯片筛选鼻咽癌紫杉醇耐药相关基因目的：探讨DNA甲基化与鼻咽癌紫杉醇耐药的相关性,采用DNA甲基化芯片联合基因表达谱芯片技术检测鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/TaxoU HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol与相应亲本细胞的甲基化谱和基因表达谱差异,并筛选出鼻咽癌紫杉醇耐药相关基因。方法：使用高效液相色谱技术(HPLC)检测鼻咽癌细胞整体甲基化水平,回归性分析DNA甲基化与鼻咽癌紫杉醇的耐药相关性。采用NimbleGen HG18甲基化芯片和Affymetrix HG-U133Plus2.0基因表达谱芯片分别分析鼻咽癌耐药细胞的甲基化谱和基因表达谱系,并结合DNA甲基化芯片和基因表达谱芯片结果分析鼻咽癌紫杉醇耐药相关基因。筛选出来的候选基因通过在线生物分析软件进行GO功能分类和KEGG信号通路分析,同时进一步通过甲基化特异性PCR(MS-PCR)和荧光实时定量PCR (Real-time PCR)进行验证。结果：鼻咽癌耐药细胞CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol均呈整体高甲基化状态,并随肿瘤细胞对紫杉醇耐药性的增强其甲基化水平增高。进一步回归性分析显示DNA甲基化与紫杉醇耐药性呈正相关。三个耐药细胞系中DNA甲基化芯片筛选出117个甲基化共同差异基因,其中高甲基化基因83个(70.94%),低甲基化基因34个(29.04%)。表达谱芯片筛选三个耐药细胞系中共同表达差异的基因有327个,其中表达上调基因129个(39.45%),表达下调基因198个(60.55%)。结合两种芯片结果筛选,获得具有甲基化差异并且表达显著改变的基因有48个。其中高甲基化、表达下调基因13个,低甲基化、表达上调基因14个。MS-PCR和Real-time PCR验证筛选的6个候选基因(CHFR、 PEG10、 ABCC5、CDKN1C、DLC1及ERBB2),结果与甲基化芯片以及表达谱芯片一致。结论：DNA甲基化与鼻咽癌紫杉醇耐药形成密切相关,DNA异常甲基化后的耐药相关基因表达改变导致肿瘤耐药的形成。DNA甲基化芯片联合基因表达谱芯片分析鼻咽癌紫杉醇耐药的方法能够有效、特异性地筛选耐药相关基因,是研究肿瘤耐药的一种非常好的手段。筛选出的候选基因通过功能分类和信号通路分析,被证明大部分参与了肿瘤耐药形成机制。CHFR、PEG10、ABCC5、GSTP1、DLC1及ERBB2经过验证,可能成为特异的肿瘤耐药标志。第二章5-aza-dC逆转鼻咽癌紫杉醇耐药性研究目的：观察5-aza-dC对鼻咽癌亲本细胞系(CNE-1、HNE-2和5-8F)和耐药细胞系(CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol)的生长抑制作用,并比较其差异。初步研究5-aza-dC对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞耐药性的影响。方法：集落形成试验检测5-aza-dC单药及5-aza-dC联合紫杉醇干预鼻咽癌亲本和耐药细胞后对细胞增殖的影响,并观察5-aza-dC逆转鼻咽癌紫杉醇耐药性的作用。运用Hochest染色法、流式细胞仪检测分析顺铂对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果：不同浓度梯度的5-aza-dC(0uM、1uM、2uM、5uM、10uM、15uM、20uM、25uM、30uM)对鼻咽癌亲本和耐药细胞增殖均有抑制作用,测得亲本细胞CNE-1、HNE-2和5-8F的IC50值分别为：9.7±0.2uM、10.5±0.6uM、11.2±0.5uM；耐药细胞系CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol的IC50值分别为：4.9±0.3uM、5.3±0.2uM、6.1±0.3uM。结果显示5-aza-dC对紫杉醇耐药细胞系的抑制作用明显高于亲本细胞(p<0.01)。5uM5-aza-dC预处理后紫杉醇对CNE-1/taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol生长抑制的IC50值分别为4.87±0.29nM、5.35±0.24、5.79±0.34,耐药指数分别为3.43±0.11、3.86±0.13、4.53±0.17其敏感性显著增加(p<0.01),而亲本细胞对紫杉醇的敏感性无明显变化(P>0.05)。流式细胞术检测发现经5-aza-dC处理的鼻咽癌耐药细胞,G0/G1期比例增加,凋亡比例增高,且显著高于亲本细胞系(P<0.05)。结论：5-aza-dC对鼻咽癌亲本及紫杉醇耐药细胞增殖均有抑制作用,紫杉醇耐药细胞对具有更高的敏感性。5-aza-dC处理后耐药细胞对紫杉醇药物的敏感性明显增加,从而可以部分逆转鼻咽癌对紫杉醇的化疗耐药。第三章5-aza-dC逆转鼻咽癌紫杉醇耐药机制研究目的：初步探讨筛选出的候选基因CHFR、PEG10、ABCC5、GSTP1、 DLC1及ERBB2在鼻咽癌紫杉醇耐药及耐药逆转中的作用。方法：MS-PCR检测5-aza-dC作用对候选基因甲基化状态的影响。并通过Real-time PCR和western blot,在mRNA及蛋白质水平对基因的表达进行验证,同时观察不同剂量5-aza-dC和紫杉醇处理对耐药细胞基因的表达影响。结果：5-aza-dC对高甲基化基因CHFR、PEG10及DLCl具有去甲基化作用,但对低甲基化基因ABCC5、GSTP1及ERBB2甲基化状态无明显影响。鼻咽癌紫杉醇耐药细胞表达下调基因CHFR、PEGIODLC1经不同浓度5-aza-dC处理后mRNA及蛋白表达均显著增强(p<0.01),而低甲基化基因ABCC5, GSTPl及ERBB2表达无明显改变(P>0.05)。但5-aza-dC对CHFR、PEG10、DLC1的表达改变在低剂量和高剂量组之间比较无显著差异。结论：CHFR、PEG10、DLC1异常高甲基化可能参与了鼻咽癌紫杉醇耐药形成过程。5-aza-dC可能通过改变CHFR、PEG10、DLC1基因的甲基化使沉默基因重新表达,从而逆转鼻咽癌紫杉醇耐药。