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脾脏是鸡体内最大的外周免疫器官,微生物感染时,很容易发生损伤,继而导致免疫抑制。出壳初期是鸡存活的关键时期,此时雏鸡的获得性免疫不足,主要是天然免疫发挥重要作用。Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs)作为天然免疫中最主要的模式识别受体,能够特异识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),从而激活体内天然免疫。其中,TLR4能够特异性地识别革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),构成天然免疫的第一道防线。TLR4广泛表达于脾脏的多种细胞内,并参与介导机体组织器官损伤,但此类研究大多集中于人和鼠,有关TLR4信号通路与雏鸡脾损伤关系的研究却鲜有报道。为此,本试验采用鼠伤寒沙门氏菌来源的LPS刺激诱导雏鸡脾损伤,运用HE染色、免疫组织化学染色、荧光定量PCR及Western Blot技术探究LPS刺激对雏鸡脾脏形态结构、脾脏细胞凋亡、炎症因子表达的影响,同时探讨TLR4信号通路在雏鸡脾损伤作用中的分子机制。主要的研究内容和结果如下:1.LPS刺激诱导雏鸡脾损伤LPS腹腔注射1日龄科宝肉鸡12h、36h和72h时,雏鸡体重极显著低于对照组(p<0.01),脾脏重量在LPS刺激36h和72h时呈下降趋势。LPS刺激12h时,脾脏椭球结构细胞发生核固缩、核溶解现象,36h时病变加深,72h核固缩、核溶解现象消失,椭球结构不明显。以上结果说明,LPS刺激可诱导雏鸡脾脏的急性损伤。2.LPS刺激对雏鸡脾脏细胞凋亡和细胞增殖的影响本试验采用免疫组织化学染色技术检测了ssDNA和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在脾脏中的表达变化;采用Q-PCR技术检测细胞凋亡通路相关因子P53、BCL2、BAK、BAX、caspase-3以及caspase-8的mRNA水平表达变化;采用Western Blot技术检测了caspase-3的蛋白水平表达变化。结果显示:LPS刺激12h和36h时,细胞凋亡显著增多(p<0.05),72h时与对照组无显著差异。LPS刺激12h和72h时,凋亡通路相关因子P53、BCL2、BAK和BAX的表达显著上调(p<0.05),36h时表达下调,caspase-3和caspase-8的表达变化无显著差异。LPS刺激12h和36h时,细胞增殖显著减少(p<0.05),72h表达接近对照组。以上结果说明:LPS刺激能够促进脾脏细胞凋亡,抑制脾脏细胞增殖,脾脏细胞凋亡主要通过活化的凋亡通路相关基因P53、BCL2、BAK、BAX介导。3.LPS刺激对雏鸡脾脏内炎性因子表达的影响本试验采用免疫组织化学染色技术研究了炎症因子IL-6在脾脏中的表达变化;采用Q-PCR技术检测了炎症因子IL-6和TNF-a的表达变化。结果显示:LPS刺激12h时,炎症因子IL-6和TNF-a的表达极显著高于对照组(p<0.01),36h时表达下调,72h时表达上调并高于对照组。以上结果表明:LPS刺激能够导致雏鸡脾脏内炎症因子的过表达,进而导致雏鸡脾损伤。4.LPS刺激对雏鸡脾脏内LEP100表达的影响本试验采用免疫组织化学染色检测了脾脏内LEP100的表达变化。结果显示:LPS刺激12h时,LEP100的表达上调并极显著高于对照组(p<0.01),36h时LEP100的表达持续升高,72h时表达下调。以上结果表明:LPS刺激能够诱导雏鸡脾脏内LEP100的过表达,从而导致雏鸡脾损伤。5.LPS刺激对雏鸡脾脏内TLR4信号通路相关分子表达的影响本试验采用免疫组织化学染色及Western Blot技术检测了脾脏内TLR4的表达变化;通过Q-PCR技术检测了TLR4及其信号通路下游分子MyD88和NF-KB的表达变化。免疫组化结果显示:LPS刺激36h时,TLR4的表达显著升高(p<0.05),72h时缓慢下降并接近对照组的表达水平;Western Blot结果与免疫组化染色结果相似,在LPS刺激36h时,TLR4的表达上调并显著高于对照组(p<0.05),72h时TLR4的表达水平接近对照组;Q-PCR结果显示,LPS刺激12h时TLR4表达下调,36h和72h时表达上调并高于对照组,LPS刺激后脾脏内MyD88及NF-KB表达呈现波浪变化,表现为12h时表达上升并高于对照组,36h时下降,72h时表达上升高于对照组。以上结果说明:LPS刺激能够激活TLR4信号通路。综合以上研究结果表明:鼠伤寒沙门氏菌来源的LPS通过激活TLR4信号通路诱导雏鸡脾脏内炎性细胞浸润、炎性因子的过表达以及细胞凋亡导致脾损伤的发生。