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心血管疾病是威胁人类健康的重大疾病。2014年中国心血管病报告指出，心血管疾病位列城乡居民死亡构成比之首，高于肿瘤、呼吸系统疾病等其他疾病。冠心病起病隐匿，常常毫无症状，但是在晚期，冠状动脉内的不稳定斑块一旦发生破裂形成血栓或斑块内出血导致管腔阻塞，便可诱发急性冠脉综合症甚至引起心源性猝死。因此冠心病不稳定斑块的早期识别、早期诊断对防治严重心血管事件极为关键。 大量研究表明动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的富集是易损斑块形成的重要标志。近期研究发现，斑块中巨噬细胞存在极化现象，其中M1型巨噬细胞能通过分泌多种炎症因子、形成泡沫细胞等方式起到促炎作用;M2型巨噬细胞则能拮抗M1型的多种生物学行为，起到抑炎作用。斑块的稳定性取决于M1与M2型巨噬细胞所占比例及其于斑块中的分布情况。 该研究选择M1型巨噬细胞特异性膜受体——巨噬细胞胶原样受体(Macrophage receptor with collagenous receptor，MARCO)，通过分子影像学技术，构建纳米多功能探针，通过在体成像观察斑块中巨噬细胞极化状态的变化，阐明巨噬细胞极化与斑块稳定性间的关系，以期为冠心病不稳定斑块的早期识别提供新方法和新依据。 研究目的:1.利用小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow-derivedmacrophage，BMDM)构建巨噬细胞极化模型，明确MARCO与不同极化状态巨噬细胞间的关系。利用巨噬细胞系raw263.7构建动脉粥样硬化的细胞模型，进一步验证MARCO与动脉粥样硬化之间的关系。 2.采用颈动脉套管结扎术+高脂喂养的方法建立ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化模型，明确目标分子MARCO在粥样硬化斑块中的表达情况。 3.采用点击化学反应构建靶向MARCO的光学/MRI多模态纳米探针（MARCO-PEG-NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4），体外测定探针的表征、靶向性、生物相容性。体内试验中，将小鼠分为对照组和动脉粥样硬化斑块组，利用荧光成像在体观测粥样硬化斑块中巨噬细胞的极化状态，并进一步进行病理学分析和探针靶向性的验证。 研究方法:1.分离小鼠骨髓细胞，诱导其成为成熟的BMDM后采用流式细胞术检测分化效率;分别给与脂多糖(LPS)+干扰素γ（IFN-γ）或白介素4（IL-4）刺激，建立M1及M2型巨噬细胞模型，实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)及酶联免疫吸附法(ELISA)进行表型鉴定。模型建立成功后Realtime-PCR、免疫荧光、流式细胞术、Western blot观测MARCO的表达情况。巨噬细胞系raw264.7给予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激后选取3h、6h、12h、24h、36h五个时间点，Realtime-PCR检测MARCO表达情况，选取表达量最高的时间点，采用免疫荧光、Western blot及流式细胞术进一步验证MARCO表达情况。 2.颈动脉套管结扎术+高脂喂养建立ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化模型，对照组选取C57小鼠并给予普通饲料，喂养24周后处死小鼠，眼球取血检测血脂四项，取其颈动脉行苏木精-伊红(HE)染色观测组织病理变化、油红染色观测脂核大小、免疫组织化学染色观测巨噬细胞浸润情况及MARCO表达情况。 3.采用化学合成法制得四氟钆酸钠参镱参铒核心外包四氟钆酸钠(NaGdF4∶ Yb，Er@NaGdF4)，利用mal-PEG将此颗粒由油相转移至水相，采用点击化学的方法活化MARCO抗体上的二硫键并与PEG-NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4相连。透射电镜、水合粒径分析、荧光光谱对探针进行表征测定;免疫荧光测定探针靶向性;CCK-8、tunel染色、流式细胞术、组织HE染色测定探针的细胞毒性。小鼠尾静脉注射该探针后分别取0min、10min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h十个时间点观测小鼠颈动脉光学信号聚集情况。 研究结果:1.小鼠骨髓细胞给予M-CSF(10ng/ml)刺激7天后F4/80、CD11b双染阳性率达87.8％可认为大部分已分化为成熟的巨噬细胞。继续给予LPS(100ng/ml)+IFN-γ(20ng/ml)刺激24小时后细胞呈长梭型，CD86表达水平上调，细胞培养液中IL-1β、IL-6含量明显升高，可以认定此种细胞为M1型巨噬细胞。给予IL-4(20ng/ml)刺激24小时后细胞呈小球型。CD206表达水平上调，细胞培养液中TGF-β含量明显升高，可以认定此种细胞为M2型巨噬细胞。 2.Realtime-PCR结果示M1型巨噬细胞中MARCO表达量高于M2型。流式细胞术示M1型巨噬细胞中F4/80、MARCO双染阳性率高于M2型巨噬细胞，差异具有统计学意义。Western blot，免疫荧光结果也提示M1型巨噬细胞中MARCO表达水平明显增加。 3.巨噬细胞系raw264.7给予ox-LDL(80ug/ml)刺激，Realtime结果提示MARCO表达于12小时达到最高。Western blot，流式及免疫荧光结果提示ox-LDL刺激12h后MARCO表达水平较对照组明显升高。 4.模型组（ApoE-/-小鼠+颈动脉套管结扎术+高脂饲料喂养）与对照组(C57小鼠+普通饲料喂养)，均于喂养24周时处死。血脂四项提示:与对照组相比，模型组小鼠血浆中总胆固醇、低密度脂蛋白水平明显上升。模型组小鼠颈动脉HE染色可见斑块表面薄纤维帽，纤维帽下可见斑块内脂质核心，免疫荧光结果提示MARCO在模型组小鼠粥样硬化斑块中表达升高，且与CD68共定位。 5.透射电镜结果提示:NaGdF4∶Yb，Er及NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4基本呈正六边形，大小均一，前者直径约12.36nm，后者直径约26.72nm。颗粒转移至水向后无团聚现象，水合粒径约122nm，偶联抗体后水合粒径约141nm。免疫荧光结果示该探针对M1型巨噬细胞有较好的靶向性。CCK-8、Turrnel染色、流式细胞术结果均表明在临床浓度下该探针的细胞毒性与同浓度的Gd-DTPA相比无显著性差异。 6.在体光学成像试验分为探针组(模型鼠注射MARCO-PEG-NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4)及无关抗体组(模型鼠注射IgG-PEG-NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4)。探针组小鼠颈部信号于4小时达最强，无关抗体组小鼠颈部于选取的十个时间点均测不到信号。 研究结论:1.易损斑块中MARCO表达含量升高，可反映反应巨噬细胞向M1型的极化程度，可作为M1型巨噬细胞的特异性标志。 2.上转换纳米探针（MARCO-PEG-NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4）具有良好的生物安全性及靶向性，可实现动脉粥样硬化中巨噬细胞的在体光学成像，反映巨噬细胞向M1型的极化情况。