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前言:褐黄血蜱（Haemaphysalis flava）是我国的优势蜱种,叮咬家畜,携带大量病原微生物,严重影响畜牧业的发展以及公共卫生安全,而开发疫苗被认为是防控蜱和蜱传病最具前景的手段。筛选可用的蛋白抗原是开发疫苗的关键一步。Cystatin（半胱氨酸蛋白酶抑制剂）是一类具有抑制半胱氨酸内肽酶活性的蛋白。根据氨基酸序列可将其分为四个家族,即Cystatin1-4。目前在蜱类中发现的Cystatin主要属于Cystatin1和2。它们主要区别在于Cystatin 2 C端存在C-PW-C模体和信号肽。蜱Cystatin存在于唾液腺、卵巢、中肠等器官,在血液消化、免疫调节、病原体入侵及胚胎发育等过程中发挥重要作用。然而褐黄血蜱Cystatin家族多数成员的全长不完整,发挥的功能也尚未被证实。本实验以褐黄血蜱Cystatin家族2成员（Hf-cyst）为研究对象,探究不同载体原核表达r Cystatin对其活性的影响,为Cystatin功能研究和应用奠定基础。方法:1.在自建库中选取编码蛋白注释为Contig24081.5127的Cystatin部分序列,分别设计5’端和3’端引物,利用c DNA末端快速克隆技术（RACE）扩增其全长,使用DNAMAN等软件将克隆出的序列与已知序列进行拼接,得到其c DNA全长。利用MEME、Signal P5.0 Server等工具对得到的全长序列进行生物信息学分析。2.将Hf-cyst2、Hf-cyst3、Hf-cyst5和Hf-cyst6的开放性阅读框（ORF）插入p ET28a载体,将Hf-cyst6的ORF插入p ET32a载体和p GEX-4T-1载体,挑取阳性质粒转入BL21（DE3）感受态细胞,培养12 h后挑取阳性菌落培养,加入诱导剂IPTG,制备不同标签的重组蛋白Hf-cyst2、Hf-cyst3、Hf-cyst5、Hf-cyst6。利用商品化纯化柱对重组蛋白进行纯化,使用Cathepsin S Inhibitor Screening Kit测定复性蛋白活性。结果:1.经扩增和拼接得到的序列全长684 bp,ORF长399 bp,编码多肽133 aa,其中1-17 aa为信号肽。MEME等分析显示其具有Cystatin 2的模体,应为Hf-cyst6,上传至Genbank,登录号为MW091499。2.SDS-PAGE结果显示6个重组蛋白均为包涵体表达,仅p ET32a载体和p GEX-4T-1载体表达的rHf-cyst6有少量可溶性表达。以p ET28a表达的rHf-cyst-2(rHf-cyst2-His28)、rHf-cyst3(rHf-cyst3-His28)、rHf-cyst5(rHf-cyst5-His28)、rHf-cyst6(rHf-cyst6-His28)以及p ET32a、p GEX-4T-1表达的rHf-cyst6(rHf-cyst6-His32、rHf-cyst6-GST),在经过变性、纯化和复性后均能够抑制Cathepsin S的活性。7个重组蛋白作用趋势一致:抑制作用都随着浓度增加而增强。rHf-cyst5-GST、rHf-cyst5-His28、rHf-cyst3-His28、rHf-cyst2-His28、rHf-cyst6-His28、rHf-cyst6-His32、rHf-cyst6-GST对Cathepsin S抑制作用达到60%的浓度分别为0.25 mg/m L、0.25 mg/m L、0.0625 mg/m L、0.05 mg/m L、0.5 mg/m L、0.2 mg/m L和0.16 mg/m L。结论:1.生物信息学分析表明克隆的全长序列为Hf-cyst6,属于Cystatin家族2。2.rHf-cyst的活性受标签蛋白影响。以p ET28a为载体表达的重组蛋白中,rHf-cyst2-His28抑制效果最好;以三个载体表达的rHf-cyst6,rHf-cyst6-GST的抑制效果最好;以p GEX-4T-1和p ET28a表达的rHf-cyst5,rHf-cyst5-GST抑制效果强于rHf-cyst5-His28。本研究的结果为选择表达载体提供了依据。