论文部分内容阅读
背景家蝇Musca domestica Linnaeus (Housefly)是世界性分布的卫生害虫之一,可传播多种疾病,对人类危害极大。长期以来人们主要使用化学方法对家蝇进行防治,导致其对多种杀虫剂产生了抗药性,这严重影响了杀虫剂的可持续防治效果,妨碍了卫生防疫工作的有效进行。因此,在了解抗药种类及抗性程度的基础上,加强科学治理是目前家蝇防控工作的重点之一。在对家蝇抗药性进行研究时,为避免野生型家蝇存在复杂的交互抗性和龄期不齐的问题,研究人员通常会在实验室内定向选育抗性家蝇以提供合适的实验对象,但目前对如何进行高效的抗药性选育尚无定论。抗药性产生的原因比较复杂,既可以是单因子作用也可以是多因子联合作用,一般可分为生理、生化和行为三种抗性机制。乙酰胆碱酯酶(AChE)作为有机磷杀虫剂(OPs)和氨基甲酸酯类杀虫剂(CBs)的共同作用靶标,在家蝇对这两种杀虫剂的抗药性中扮演着重要角色。目前已研究证实家蝇的AChE由其体内Ace基因编码,Ace基因点突变可导致AChE结构改变,变构的AChE对杀虫剂亲和力降低,表现为敏感性下降,从而使家蝇产生抗药性。已有学者总结出家蝇的15个Ace等位基因,其中有11个等位基因可编码出对杀虫剂敏感的AChE,其余4个等位基因编码的AChE对杀虫剂有不同程度的不敏感性。随着对抗性机制研究的深入,抗药性的生物、化学和分子生物学检测方法发展很快,与传统的生物学方法相比,新方法在准确性、重复性及抗性早期检测等方面有明显的优势,但由于技术、成本以及无法对昆虫整体做评估等原因,新方法目前主要用于遗传学方面的研究,尚未作为基层抗性检测常规手段使用。本研究的目的就是在对抗性家蝇选育方法进行规范的基础上研究抗性家蝇AChE的生化特征,据此建立一种快速易行的家蝇对敌敌畏(DDVP)抗药性初步检测方法,同时分析选育出的抗性家蝇Ace基因突变结果。方法本研究采用DDVP对实验室敏感品系家蝇进行抗性选育,用点滴法测得选育后各代家蝇半数致死量(LD50),计算抗性系数,对药膜法、点滴法和幼虫汰选法三种选育方法进行比较;同时以幼虫数量、幼虫均重、蛹数量、蛹均重、成虫数、成虫均重、化蛹时间和羽化时间为评价指标,探讨DDVP对家蝇幼虫的毒性作用。提取选育所得不同抗性的家蝇头部粗酶源,对其定量后进行酶促反应实验,以碘代硫化乙酰胆碱(ATCh)为底物,5,5-双二硫代(2-硝基苯甲酸()DNTB)为显色剂,通过测定不同反应时间下反应体系吸光度(A)值,计算AChE的活性和抑制活性,比较不同世代家蝇AChE对DDVP敏感性的差异,在此基础上确定可完全抑制敏感家蝇AChE活性的DDVP浓度,据此建立通过直接观察显色反应定性检测家蝇抗药性的方法。提取敏感及抗性家蝇体内RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到家蝇Ace基因片段,用DNAstar软件分析比对敏感与抗性家蝇Ace基因序列,再利用BLAST Sequence Similarity Searching工具,将测得序列与GenBank中注册过的家蝇Ace抗药性等位基因核苷酸序列进行同源性比较,在分子水平上对选育家蝇的抗药性进行验证。结果对抗性系数为1.29的家蝇使用药膜法、点滴法和幼虫汰选法分别进行5次抗药性选育后,抗性系数各达到2.12、8.91和19.35倍,各代家蝇的体重无显著差异。DDVP对家蝇幼虫的毒性主要表现为致死和致畸作用,幼虫存活率、化蛹率、羽化率均以及蛹均重和成虫均重与DDVP浓度呈负相关,畸变的数量和程度与DDVP浓度成正比,但给药浓度对家蝇幼虫化蛹时间及羽化时间的影响不大,家蝇的性别比也与DDVP浓度无统计学差异。各抗性家蝇与敏感家蝇的粗酶蛋白含量及AChE活性的差异均无统计学意义,各世代家蝇AChE的抑制活性与DDVP浓度呈负相关,但在一定范围内(DDVP浓度<0.6mg/mL时),抗性家蝇AChE均表现出一定的不敏感性,抗性系数越高,不敏感性越强。据计算,随着抗药性的加大,DDVP对AChE的抑制中浓度显著增大。经实验分析后,把0.08mg/mL作为DDVP对敏感家蝇和抗性家蝇活性抑制的临界浓度,可用来进行抗药性的快速检测。Ace基因测序结果表明培育出的抗性家蝇与敏感家蝇相比存在7个点突变、1处插入和1处缺失现象。结论1.与药膜法和点滴法相比,用幼虫汰选法培育家蝇抗药性的抗性产生速度更快;2.幼虫期施药不会延缓家蝇发育时间,但对家蝇的数量和重量有影响;3.家蝇对有机磷杀虫剂产生抗药性与其体内AChE含量增加或活性增高无关,是AChE对杀虫剂敏感性下降造成的;4.通过本课题的研究,初步建立家蝇对DDVP抗药性快速定性检测方法;5.本实验选育得到的抗性家蝇Ace基因序列与GeneBank中注册的Ace抗药性等位基因v15(注册序列号FJ174267.1)序列完全一致。