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吸烟是世界上最大的公共卫生问题之一。目前,每年死于吸烟引起的相关疾病的人数已经超过600万;其中有超过500万人是主动吸烟,而因为二手烟致死的非吸烟者人数则超过60万。我国目前烟民数量已经超过3亿,其中15岁以上人群吸烟率为28.1%,男性的吸烟率高达52.9%。吸烟除了会引起呼吸系统等疾病外,流行病学研究还发现男性出生缺陷、甚至不孕不育也都与吸烟密切相关。研究目的:本实验室前期研究发现吸烟会使雄性小鼠精液量、精子密度等精子质量指标产生不同程度的降低。为了进一步阐明吸烟是如何对精子产生这些影响的,本实验着重研究了尼古丁对小鼠生精细胞凋亡的影响,因为细胞凋亡与精液量、精子密度等指标密切相关;并进一步深入研究了尼古丁造成这样影响的分子机制。研究方法:本研究首先构建了尼古丁处理小鼠模型;并采用DNA ladder检测睾丸组织整体凋亡水平,用TUNEL研究睾丸组织发生凋亡的细胞的种类与数目,用透射电子显微镜观测正常和凋亡的长形精子细胞的超微结构,以及用Western blot的方法检测精子中Caspase3的活化状态的蛋白表达水平;之后用生物信息学的方法对精子转录本二代测序数据进行分析来寻找可能的在尼古丁处理后发挥作用的凋亡通路,并用Western blot和RT-PCR的方法对可能的凋亡通路进行验证,之后对差异表达的基因进行甲基化分析以及甲基化调控基因表达验证实验,最后在小鼠精原细胞系中对发现的甲基化调控基因进行过表达与抑制实验,以验证该基因对信号通路以及细胞凋亡的影响。结果:尼古丁会导致小鼠睾丸组织生精上皮周期Ⅰ,Ⅶ,Ⅷ和Ⅺ期的精原细胞;Ⅰ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅹ和 Ⅺ期的精母细胞;以及Ⅰ–Ⅴ,Ⅶ和Ⅷ期的长形精子细胞凋亡显著增加。进一步对小鼠精子转录本二代测序的数据进行分析发现,经尼古丁处理后,86个与凋亡相关的基因的表达量都发生了不同程度的改变,其中肿瘤坏死因子α的表达量上调最为显著;并且信号通路分析结果表明TNF凋亡通路被显著激活。因此我们从基因和蛋白水平对睾丸组织中TNF凋亡通路进行了进一步的研究。研究结果证实TNF凋亡通路在睾丸组织被显著激活,并且该通路的关键蛋白之一RIP1,其非泛素连接状态的蛋白的表达量发生了显著上调。随后,我们发现TRIM27,一个可以通过上调非泛素连接状态的RIP1进而激活TNF凋亡通路的E3泛素连接酶,它的表达量在睾丸组织也发生了显著上调;并且重亚硫酸盐测序结果表明该基因启动子区域的一个CpG岛发生了显著的低甲基化。最后,在小鼠精原细胞系中进行的TRIM27的过表达和RNA干扰实验证明了Trim27的低甲基化与RIP1的去泛素化以及精母细胞的凋亡都呈正相关的关系。结论:尼古丁可以通过介导Trim27启动子低甲基化导致非泛素连接状态的RIP1上调,进而激活TNF凋亡通路导致小鼠长形精子细胞凋亡增加。