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研究背景与目的食管癌发病率居恶性肿瘤第四位。我国食管癌发病率一直位于前列,全世界近50%的食管癌发生在中国,截止2015年底,我国新发食管癌患者达到了47.79万人,食管癌已然成为严重威胁人类健康的疾病之一。我国临床上常见的食管癌类型为食管鳞状细胞癌,浸润和转移是其高死亡率的原因。研究表明,食管癌的发生和浸润、转移是多项因子共同协同的结果,浸润在肿瘤组织间质中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumour associated macrophages,TAMs),TAMs在不同的微环境下表现出不同的功能活化,一般分为两种:一种是经典活化的巨噬细胞,也称为M1型巨噬细胞,在肿瘤进程中对瘤细胞具有抑制和杀伤的作用;另一种是替代性活化的巨噬细胞,称为M2型巨噬细胞,具有促进肿瘤细胞增殖的作用。研究发现在胃癌、肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤的侵袭和转移过程中都可见M2型巨噬细胞的出现。本实验旨在探讨M2型巨噬细胞参与食管癌脉管生成的可能机制,从而为进一步寻找抑制食管癌转移的新靶点提供理论依据。方法1.将人淋巴瘤U937单核细胞进行培养,采用免疫细胞化学标记该细胞中CD206、CD163的表达,鉴定其表型。2.采用pma及白介素-4(il-4)将人淋巴瘤u937单核细胞诱导为单核细胞来源的m2型巨噬细胞,与食管癌ec9706细胞共培养作为实验组,将单独培养的食管癌ec9706细胞作为对照组。3.运用酶联免疫吸附测定法(elisa)分别检测两组细胞上清液中血管内皮生长因子(vegf)、血管内皮生长因子-c(vegf-c)的浓度。4.采用westernblot方法检测两组细胞的vegf、vegf-c蛋白的表达。5.运用rt-pcr法检测各组细胞中vegf、vegf-cmrna的表达。6.采用免疫组织化学法(sp法)检测实验组与对照组移植瘤组织中vegf、vegf-c的表达,并运用cd206、cd163标记tams。7.利用原位杂交法检测各组裸鼠移植瘤组织中vegfmrna、vegf-cmrna的表达。8.采用免疫组化对cd31染色,标记各组裸鼠移植瘤组织中的血管,计算mvd值。9.采用免疫组化对d2-40染色,标记各组裸鼠移植瘤组织中的淋巴管,计算lmvd值。10.实验数据使用spss17.0统计软件处理,符合正态分布的计量资料,统计分析采用均数±标准差(x±s);阳性率的比较采用χ2检验;计量资料均数间的比较采用t检验,检验水准α=0.05。结果:1.人淋巴瘤u937单核细胞cd163,cd206阳性表达率均为100%。说明人淋巴瘤u937单核细胞可作为tams细胞继续后续实验。2.人淋巴瘤u937细胞通过白介素-4诱导18h后,形态由球型逐渐变为多边形,并开始贴壁生长。3.elisa方法检测实验组细胞上清液中vegf浓度为(104.33±0.79),对照组浓度为(99.81±0.63),两组结果进行比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。实验组vegf-c浓度为(224.85±29.33),对照组浓度为(208.40±24.59),实验组>对照组,具有统计学差异(p<0.05)。4.westernblot检测实验组中vegf蛋白的表达量为(0.60±0.04),对照组vegf蛋白表达量为(0.19±0.02),二者比较,实验组表达量>对照组,差异具有显著性(p<0.05)。实验组vegf-c蛋白的表达量为(1.13±0.23);对照组VEGF-C蛋白表达量为(0.75±0.12),两者比较,实验组表达量高于对照组,差异具有显著性(P<0.05)。5.经过RT-PCR实验检测,实验组中VEGF mRNA表达量(1.33±0.03)大于对照组(1.18±0.02),两组比较有差异(P<0.05);实验组VEGF-C mRNA表达量(1.38±0.06)大于对照组(1.08±0.04),两组比较有差异(P<0.05)。6.免疫组织化学检测实验组移植瘤组织中VEGF蛋白表达率(52.41±15.26%)明显高于对照组(45.19±18.63%),两者比较具有统计学差异(P<0.05);实验组VEGF-C蛋白表达率(48.23±15.32%)大于对照组(40.69±12.78%),且具有统计学差异(P<0.05)。7.免疫组化检测实验组中CD206的计数(31.22±14.27个/HP)高于对照组(26.83±12.11个/HP),差异具有显著性(P<0.05)。实验组中CD163的计数(29.78±12.36个/HP)高于对照组(22.53±10.38个/HP),两组之间比较具有统计学意义(P<0.05)。8.原位杂交方法检测VEGF mRNA的表达,结果实验组阳性率(31.63±13.21%)明显高于对照组,(P<0.05)。实验组中VEGF-C mRNA阳性率(37.51±3.59)明显高于对照组(31.27±3.12%),两组之间比较具有统计学差异(P<0.05)。9.实验组MVD值为(29.21±5.78个/HP),对照组MVD值为(26.58±6.53个/HP),差异具有统计学意义(P<0.05)。10.实验组LMVD值为(12.13±1.37个/HP),对照组LMVD值为(10.09±1.21个/HP),两组比较,差异具有显著性(P<0.05)。结论1.人淋巴瘤U937单核细胞作为TAMs细胞,可以促进食管癌EC9706细胞分泌VEGF、VEGF-C因子。2.M2型巨噬细胞可通过VEGF、VEGF-C促进裸鼠食管癌移植瘤组织血管、淋巴管的生成。