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在全球所有恶性肿瘤当中,肺癌的发病率以及死亡率位列榜首。我国是肺癌的高发国家,尤其近些年来在城市人群中肺癌的发病率持续升高,严重威胁着人们的生命健康。肺癌按照病理分型分类可分为:非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)。其中非小细胞癌在所有肺癌中约占80–85%,是最常见的类型。随研究的不断深入,治疗的手段也不断的丰富。在众多的治疗方式中,化学治疗发挥着重要的作用,但经典的化疗存在着特异性低的特点,因此在治疗过程中经常会影响到正常细胞组织的生存、生长,从而出现骨髓造血功能抑制、胃肠道反应等副反应。另外现阶段的化疗药物同时还普遍存在着耐药现象。为解决上述问题,我们需要更加深入的从分子水平上研究肺癌细胞的发生发展,并且寻找新型的,抗肺癌效果更确切、毒副作用更低的治疗药物。食道癌是世界上常见的恶性肿瘤之一。在肿瘤所致的死亡率排名中位于第7,严重威胁着人们的生命健康安全。其中食管鳞状细胞癌(SCC)是最常见的食管癌病理分型。虽然在过去的几十年里,手术和辅助化疗使患者的症状得以缓解,生活质量得以改善,但是食道癌患者的5年生存率仍小于30%。食管癌对化疗药物敏感性不高,并且化疗药物常带有明显的副作用。因此,探索新的、更有效的、更加安全的治疗药物是十分必要的。近些年来,一系列以我国传统中药单体作为新型抗肿瘤药物的研究受到高度关注。经研究这些药物常常特异性的作用于肿瘤细胞凋亡与细胞周期,参与相关信号通路的调控,从而诱导肿瘤细胞凋亡、细胞周期发生阻滞,抑制了肿瘤细胞的增殖,为肿瘤的预防以及治疗提供了新的方法,为探究肿瘤的分子学机制提供了研究方向。木香烃内酯(Costunolide,CT)为倍半萜内酯类化合物,是中药木香的主要化学成分之一。木香烃内酯具有广泛的药理活性,具有抗肿瘤、抗溃疡、抗炎、抗真菌以及抗病毒等多种活性。其中抗肿瘤为其主要药理活性,且存在多种抗肿瘤机制,对多种肿瘤细胞表现出较好的抑制作用,千金藤素(Cepharanthine,CEP)是一种天然的植物生物碱,主要来自中药千金藤属植物千金藤,既往的研究表明其具有抗炎、免疫调节的作用,最近的一些研究表明千金藤素具有潜在的抗肿瘤作用。但是在抗非小细胞肺癌及抗食管癌方面,没有研究报道过木香烃内酯和千金藤素的作用。所以本实验拟研究木香烃内酯对非小细胞肺癌、食管癌的作用效果,千金藤素对非小细胞肺癌的作用,以及其具体的机制。前期的细胞抑制实验中,我们发现木香烃内酯对人肺鳞癌SK-MES-1细胞、人肺腺癌A549细胞、人非小细胞肺癌H1299细胞以及人食管鳞癌Eca-109细胞显著的抑制作用,千金藤素则是对3种NSCLC细胞增殖抑制明显。为探究其具体的作用机制,我们进行了以下研究。实验一,我们主要应用人肺鳞癌SK-MES-1细胞作为实验对象来研究木香烃内酯的抗癌机制。木香烃内酯可诱导SK-MES-1细胞发生形态结构上的改变,同时生长增殖也受到抑制。流式细胞分析证明经木香烃内酯处理的SK-MES-1细胞发生了细胞凋亡,并且细胞周期被阻滞在G1/S期。通过western blot(蛋白免疫印迹)进行蛋白分析,p53、Bax、p21的表达量上调,Bcl-2下调,caspase-3被激活,其下游的PARP(Poly ADP-Ribose Polymerase,天冬氨酸蛋白水解酶)分裂。另外实验发现线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)发生了明显的下降,这些结论清晰的证明了线粒体介导的Caspase活化途径存在于木香烃内酯诱导SK细胞凋亡的机制中。这些发现提示我们木香烃内酯在未来有望成为抗肺癌治疗的新型化合物。实验二,我们应用人非小细胞肺癌A549,H1299细胞作为实验对象来探究小分子药物千金藤素的抗肺癌机制。实验发现千金藤素可以通过浓度依赖的方式抑制A549,H1299细胞的生长,且通过流式的检测,经处理的这两种细胞发生了细胞凋亡,上述的现象均可被活性氧(ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)所拮抗,这表明木香烃内酯导致的非小细胞凋亡是由ROS所介导的。另外,通过流式细胞术检测细胞周期的实验显示,千金藤素阻滞H1299细胞周期在S期;阻滞A549细胞周期在G2/M期,表明千金藤素同时可以作用于细胞周期的调定点。通过western blot分析相关蛋白的水平变化,结果显示,促凋亡蛋白Bax蛋白上调、抗凋亡蛋白Bcl-2下调,同时caspase-3活化,伴随着下游PARP裂解。这些证据表明千金藤素激活了线粒体通路,导致了凋亡的发生。这些研究结果证实千金藤素可能成为未来抗肺癌治疗的一个潜在的化合物。实验三,探究木香烃内酯抗食管癌Eca-109细胞的作用机制。通过流式细胞术检测细胞周期分布,结果显示木香烃内酯阻滞Eca-109细胞周期在G1/G0期。同时通过流式细胞术还发现,木香烃内酯可明显诱导人食管鳞癌Eca-109细胞细胞凋亡水平明显上升,同时可以显著上升ROS的水平、破坏线粒体膜电位。通过western blot分析蛋白水平的变化,周期相关蛋白p53,p21表达上调,Bcl-2家族中抗凋亡蛋白下调,促凋亡蛋白上调,同时caspase-3被激活,以及伴随着下游的PARP裂解。以上的现象均可以被NAC所抑制。这些数据表明木香烃内酯抑制人食管鳞癌细胞生长增殖,与ROS水平以及p53介导的线粒体途径密切相关。综上所述本研究以人非小细胞肺癌细胞株、人食管癌细胞株为研究对象,筛选具有抗肿瘤的活性的天然小分子化合物并研究了其作用机制,为肺癌、食管癌的治疗提供了新的思路,同时也为木香烃内酯、千金藤素潜在进入临床治疗的可能性提供一定的理论依据。