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鹅肥肝是一种高档营养食品,具有很高的经济价值。在农业生产中,采用填饲富含碳水化合物的高能饲料生产鹅肥肝,伴随着血清胰岛素和葡萄糖浓度的升高,肝脏体积和重量增加5～10倍,肝细胞发生脂肪变性,但仍保持其生理功能。现有研究表明胰岛素和葡萄糖在细胞增殖中发挥了重要作用,因此在鹅肝脂肪变性过程中可能伴随着肝细胞的增殖。为探索胰岛素、葡萄糖对鹅肝细胞增殖的影响及调控机制,将同一天孵化的健康雄性天府肉鹅和钢鹅各80只群养至13周龄,天府肉鹅和钢鹅各60只用于填肥,作为试验组,另外20只作为对照组。其中填肥组经7天预填肥和21天正式填肥,对照组则按正常方式饲养。所有动物在17周龄时采血,并屠宰采集相关组织样品,以研究填肥对鹅生长性能,血清胰岛素、葡萄糖和甘油三酯(TG)浓度,以及与细胞增殖相关基因的mRNA表达水平的影响;同时,通过分离培养天府肉鹅原代肝细胞,采用实时荧光定量PCR、Western blot、ELISA等技术,研究胰岛素、葡萄糖、PI3K-Akt-mTOR信号通路、转录因子FoxO1和Sirt1对鹅肝细胞增殖的影响,以揭示胰岛素、葡萄糖对鹅肝细胞增殖的调控机制,并阐明碳水化合物诱导鹅肥肝形成的机理,为解析鹅肝脂肪变性提供新思路。此外,作为肝脂肪变性模型,鹅肥肝为脂肪肝等疾病的预防与治疗提供可借鉴的研究“载体”,具有重要的科学价值和实践意义。取得的主要结果如下:1、与对照组相比,填肥21天后,天府肉鹅和钢鹅体重、肝脏重、腿肌重、腹脂重、皮脂重显著增加;血清胰岛素、葡萄糖和TG浓度均显著升高;天府肉鹅肝脏中PI3K、Akt1基因的表达量显著高于腿肌和胸肌中的表达量,而钢鹅肝脏中Akt1、mTOR基因的表达量显著高于腿肌和胸肌中的表达量,rictor、raptor、S6K在天府肉鹅肝脏中的表达量增加显著,而在钢鹅肝脏中的表达量增加不显著;天府肉鹅和钢鹅肝脏中Fox01、Sirt1基因表达量显著降低,而CyclinD1/D2/D3基因表达量显著增加。填肥后天府肉鹅和钢鹅肝脏、胸肌、腿肌中CyclinD1蛋白含量显著增加。2、胰岛素刺激细胞周期启动因子CyclinD1/D2/D3的基因表达和蛋白表达水平,抑制p21、p27的基因表达和蛋白表达水平。同时,胰岛素刺激涉及PI3K-Akt-mTOR信号通路的基因表达和蛋白表达水平。LY294002、Rapamycin、NVPBEZ235三种PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂降低CyclinD1/D2/D3的基因表达和蛋白表达水平,增加p21、p27的基因表达和蛋白表达水平,胰岛素能够在一定程度上逆转上述三种抑制剂的抑制作用。浓度为5 mmol/L或35 mmol/L葡萄糖均能促进鹅原代肝细胞增殖,激活PI3K-Akt-mTOR信号通路。三种PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂均显著降低葡萄糖诱导的鹅原代肝细胞增殖的作用。葡萄糖或胰岛素单一处理、与葡萄糖和胰岛素共同处理均显著增加鹅原代肝细胞的DNA合成率及其CyclinD1/D2/D3的基因表达和蛋白表达水平。3、干扰质粒(miRNA-FoxO1)抑制FoxO1后,导致鹅原代肝细胞的DNA合成率及其CyclinD1/D2/D3的基因表达水平显著增加,p21、p27的基因表达水平显著降低;miRNA-FoxO1使CyclinD1的蛋白表达水平增加。胰岛素、miRNA-FoxO1及二者共同处理均使鹅原代肝细胞增殖增加;PI3K-Akt-mTOR信号通路的双重抑制剂NVP-BZE235减弱了 miRNA-FoxO1对鹅原代肝细胞增殖的刺激作用。4、作为Sirt1的抑制剂,维生素PP使鹅原代肝细胞DNA合成率、BrdU阳性细胞率、增殖指数(PI)及CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加;而FoxO1的基因和蛋白表达水平下降;miRNA-FoxO1使鹅原代肝细胞增殖增强,CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加,而Sirt1的基因和蛋白表达水平降低;维生素PP和miRNA-FoxO1共同处理使鹅原代肝细胞增殖增强,CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加;而FoxO1和Sirt1的基因表达和蛋白表达水平均降低;维生素PP或胰岛素单一处理,以及二者共同处理均能刺激鹅原代肝细胞增殖,CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加;而p21的基因表达和蛋白表达水平降低;PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂(LY294002、Rapamycin、NVP-BEZ235)均能减弱维生素PP诱导的鹅原代肝细胞的增殖。综上所述,在鹅肥肝中存在肝细胞的增殖;填肥、胰岛素、葡萄糖均可影响PI3K-Akt-mTOR信号通路,诱导细胞周期正调控因子CyclinD1/D2/D3的mRNA表达和蛋白表达,抑制细胞周期负调控因子p21、p27的mRNA表达和蛋白表达,促进鹅肝细胞增殖;FoxO1、Sirt1在鹅肝细胞增殖中起抑制作用。鹅肝细胞增殖可能是应对肝细胞脂肪变性,保持肝细胞正常生理功能的需要。