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研究背景皮肤是机体和外界环境接触的最外层器官,作为机体的屏障,皮肤可抵御外来刺激和伤害、保护机体内部组织。对于烧伤患者而言,烧伤创面既是烧伤对机体所造成损害的集中典型表现和烧伤诊断的重要依据,也是烧伤治疗的重点内容和评价治疗效果的关键指标。在治疗过程中,封闭创面(再上皮化)乃是烧创伤患者治疗的焦点,在该过程中,角质形成细胞经过一系列复杂精细的事件失去上皮细胞特征,获得间充质细胞特征(即上皮-间充质转换),从静止细胞转换运动细胞,启动迁移,并移行至创面。上皮-间充质转换是创面愈合的基础,细胞获得的迁移能力则是再上皮化过程的启动事件及重要环节。细胞完成启动过程、获得迁移能力后,沿着创面逐渐移行。在迁移过程中,角质形成细胞经过伪足形成、胞体收缩、粘附解离等过程纵向延伸,从创缘向创面迁移。自噬(本文中自噬皆指大自噬,macroautophagy)是通过溶酶体降解、再利用自身受损的细胞器和多余的大分子物质的一条主要分解代谢途径,降解的底物可以提供能量,重建细胞结构。研究表明,自噬参与了生物体的发育、分化、免疫等过程,和某些疾病如肿瘤的侵袭、转移有关。黏着斑、整合素家族、黏着斑激酶和Rho家族相关蛋白等在细胞迁移过程中发挥着重要作用,自噬可降解多种细胞中的黏着斑脚手架蛋白、信号整合器等,参与调控细胞迁移。正常皮肤中存在着跨上皮电势差,创面形成后,跨上皮电势差消失,同时产生内源性的直流电场。该直流电场以创缘为正极,创面中心为负极,在创面修复的全过程中持续存在并影响细胞的行为。研究表明,电场是指导角质形成细胞从创缘向创面定向移行的关键微环境因素,但其促进细胞启动及获得运动能力的机制尚不清楚。考虑到上皮-间充质转换及自噬在细胞迁移中的重要作用,我们推测或许与这两种现象有关,但电场是否及如何引起细胞发生上皮-间充质转换、加电时细胞内自噬活性如何、自噬是否与角质形成细胞迁移有关等问题均不得而知,故本课题着眼于这些问题,探索创面修复过程中电场与细胞迁移的关系以及上皮-间充质转换和自噬在迁移中发挥的作用。急性创面形成时,患者皮肤屏障受损,体液丢失,机体有效循环血量减少,组织氧供及血供减少;创面局部血管网受损后,组织的氧供进一步减少,同时由于创面肉芽组织生成、炎症细胞浸润等,组织氧耗增加。整体因素和局部因素共同作用,氧供和氧耗失去平衡,创缘组织处于缺氧状态。在创面修复过程中,缺氧微环境持续存在并影响修复过程,直至再上皮化完成后才会消失,因此其重要性不言而喻。研究表明,缺氧环境与角质形成细胞开始迁移的时间及位置一致,在前期研究中,我们发现缺氧可促进角质形成细胞发生EMT,但它促进细胞运动性的相关机制尚不明确。故本课题通过多种实验技术,研究创面修复过程中缺氧与细胞迁移的关系以及可能的机制。方法1.原代角质形成细胞的分离与培养向皮肤组织中加入中性蛋白酶,置于4℃冰箱中16-18h。所得的表皮剪碎后用0.25%的胰酶消化6-7min。过滤所得混合物后,将滤液离心10min,弃上清,重新致悬计数,根据实验需求接种细胞。2.si RNA转染稀释lipofectamine 2000和si RNA溶液,将所得的两种稀释液轻柔混匀,室温放置20min后加入细胞培养体系中。6h后更换培养基,继续培养24-48h后进行实验。3.腺病毒转染接种细胞在六孔板中,密度适宜时吸取腺病毒原液2μL,与2m L培养液混合,轻轻吹打混匀后加入培养板,在孵箱中培养24h后更换新鲜培养液,继续培养24-48h。其他类型的培养皿、培养孔板或大、小爬片所需的试剂体积按培养面积、培养体积换算。4.材料制作用玻璃刀制作小爬片、大爬片、电场室、银丝电极、盐桥,改造Costar 24孔板,放入电场小室,通过盐桥、ST导电液、电极等形成回路。5.加电处理细胞对电场室进行消毒灭菌后,加入适量培养基,排除气泡。将爬片放入电流通过的空间,固定。加入ST导电液,放入盐桥、银丝,置于培养箱中,接通外加电源,构建回路。6.活细胞工作站检测单个细胞运动能力打开活细胞工作站,将电场小室与24孔板组合放入电场中。选择视野,打开外接电源,调整电源输出直至测量值达到实验要求,拍照记录。7.划痕实验检测细胞侧向迁移能力细胞培养成为单层后,用枪头自上而下均匀用力制作划痕。冲洗,加入新鲜的培养液,拍照记录,根据实验目的进行处理(加入药物或电场刺激)。之后每6h利用显微镜拍照,观察细胞迁移情况。8.Western blot加入蛋白裂解液裂解所有细胞,刮下裂解液,吸出后存放于EP管中,在沸水中煮5-10min,彻底变性,定量,根据定量结果上样。恒压电泳后转膜,裁剪目的条带,用5%BSA或5%脱脂奶粉室温封闭1-3h。按比例稀释一抗,4℃冰箱中孵育18-20 h。次日用TBST洗膜,按比例稀释二抗,室温孵育1h后洗膜。曝光,保存图像。9.免疫荧光染色用复温的4%多聚甲醛固定爬片,打孔,3%BSA封闭1 h。按比例稀释一抗,4℃冰箱中孵育18-20h。用PBS洗5次×3min后,按比例稀释二抗,37℃孵育1h,随后室温孵育DAPI 5min染核,封片。激光共聚焦显微镜拍照,保存图像。结果1.电场通过下调PTEN激活m TORC1而引起EMT,启动细胞迁移。1.1外加直流电场处理可促进角质形成细胞发生EMTWestern Blot及免疫荧光染色显示,外加直流电场处理可显著增加Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白的表达水平,且这种促进作用呈时间依赖性,说明电场促进细胞发生EMT转换。1.2外加直流电场处理引起细胞运动能力增加电场处理可明显促进单个细胞运动距离及轨迹速度;电场组细胞迁移面积大约是正常组2倍,说明电场可显著增加促进单层细胞侧向迁移。1.3外加直流电场处理抑制角质形成细胞PTEN表达正常细胞中PTEN蛋白表达水平较高,电场可引起其表达下降,加电时间越长,PTEN含量下降越明显。1.4外加直流电场通过下调PTEN引起EMT用si RNA下调PTEN表达水平后,在相同的电场处理条件下,该组中Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表达水平较单纯加电细胞更高,E-cadherin表达水平更低,说明降低电场处理时的PTEN水平可进一步促进EMT发生。用腺病毒过表达PTEN后,在相同的电场处理条件下,该组Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表达水平显著降低,E-cadherin表达水平恢复,提示过表达PTEN可抑制EMT发生。1.5外加直流电场通过下调PTEN促进细胞运动性在相同的电场处理条件下,进一步下调PTEN后细胞运动范围增加,平均运动距离及轨迹速度增大,过表达PTEN组细胞运动范围缩小,平均运动距离及轨迹速度降低;划痕实验结果一致。1.6外加直流电场可激活角质形成细胞m TORC1通路p-p70S6K和p-4E-BP1的表达水平随着电场处理时间的延长而逐渐增加,呈时间依赖性,说明电场处理可以激活m TORC1通路。1.7外加直流电场通过激活m TORC1通路引起EMT加电可促进细胞发生EMT转换,用Rapamycin处理抑制m TORC1后则会导致Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表达水平显著降低,E-cadherin表达水平恢复,逆转电场引起的EMT。1.8外加直流电场通过激活m TORC1通路促进细胞运动性电场处理使细胞的运动范围增加,运动能力增强,加入Rapamycin抑制m TORC1后细胞运动范围缩小,运动速度下降,说明电场引起的m TORC1活化在单个细胞运动性中发挥重要作用。划痕实验观察结果一致。1.9外加直流电场通过下调PTEN激活m TORC1通路电场处理可激活m TORC1,加入si PTEN会进一步引起m TORC1活化;Rapamycin可显著抑制m TORC1活性,但不影响PTEN的表达水平,说明PTEN可负向调控m TORC1的活性。在相同的电场处理条件下,加入Rapamycin会抑制si PTEN对EMT的诱导,Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表达水平下降,E-cadherin表达水平恢复,说明PTEN下调诱导EMT时需要活化的m TORC1。1.10 m TORC1失活可抑制由PTEN下调所引起细胞运动性与6h+si PTEN组相比,6h+si PTEN+Rapamycin组细胞运动范围明显缩小,平均运动距离、轨迹速度下降,有显著统计学差异,说明PTEN下降引起的细胞运动性增加需要m TORC1的参与。划痕实验观察结果一致。2.电场通过激活自噬促进细胞定向迁移能力2.1外加直流电场处理促进角质形成细胞定向迁移正常情况下,细胞随机向各个方向运动,无明显的方向性,运动范围较小。电场处理使细胞从正极向负极移动,运动方向逐渐接近水平,细胞运动范围明显增大,说明外加直流电场处理可以促进细胞定向迁移。2.2外加直流电场处理可增加细胞自噬水平Western blot结果表明,电场可引起Ha Ca T和MKs细胞中自噬经典标志物LC3-II、p62表达增多,这种促进作用呈时间依赖性。电镜结果显示,正常情况下细胞中自噬水平很低,电场刺激后自噬数目增加,多为单层膜结构,是已经成熟的自噬溶酶体,胞浆成分已部分或全部降解。用GFP-LC3腺病毒转染细胞后加电处理,发现正常情况下细胞中自噬水平很低,绿色荧光无点状聚集,加电后胞浆中出现大量点状绿色荧光,即自噬体。该结果与前述结果一致,说明电场可增加细胞自噬水平。用针对LC3的抗体通过免疫荧光染色检测细胞本身的内源性蛋白,发现电场处理可以增加自噬水平。2.3电场条件下细胞自噬流通畅电场条件下,用ACTD处理细胞后,p62、LC3-II表达水平降至与正常细胞中p62、LC3-II表达量相等,说明加电时p62、LC3-II表达增高是由电场刺激基因转录、翻译增加引起的。电场条件下,与单纯加电组相比,CQ和Baf A1可引起p62、LC3-II水平显著升高,说明加电时细胞自噬流通畅,抑制剂阻断了降解过程的关键步骤,引起降解障碍,造成p62和LC3-II堆积。用GFP-LC3腺病毒转染细胞并加电,发现红色荧光和绿色荧光完全重叠,形成嫩黄色,说明自噬体和溶酶体共定位好,提示二者融合无障碍,自噬流通畅。电镜发现加电后细胞中自噬多为单层膜结构,是已经成熟的自噬溶酶体,胞浆成分已部分或全部降解。说明加电时自噬体和溶酶体融合成熟无障碍,融合后可顺利降解底物,提示自噬流通畅。2.4敲除ATG5基因引起细胞自噬水平下降在正常情况下,用si RNA敲减ATG5后,加电处理不再引起si ATG5细胞自噬水平增加,LC3下调,p62累积,说明敲除ATG5可抑制电刺激对自噬的促进作用。2.5电场条件下自噬促进角质形成细胞定向迁移正常情况下,细胞向各个方向运动,无方向性,运动轨迹集中,运动范围都比较小,电场处理可促进细胞定向迁移。与加电组相比,敲除ATG5的细胞加电后仍可定向迁移,但运动范围减小,轨迹速度、位移速度、X轴方向位移速度显著下降,说明外加直流电场处理通过自噬促进角质形成细胞定向迁移能力。3.1缺氧处理激活角质形成细胞中m TORC1通路Western blot结果显示,MKs细胞缺氧3h、6h、12h后p-p70S6K和p-4EBP1表达水平均显著上升,有统计学差异。p70S6K、4EBP1总蛋白表达水平不受缺氧处理的影响。Ha Ca T细胞接受缺氧处理后亦出现类似的现象。正常情况下,p-p70S6K主要分布在细胞核中,缺氧处理后荧光染色亮度增强,核中点状阳性染色增加,p-4EBP1染色得到相似的结果,说明缺氧处理激活角质形成细胞中m TORC1通路。3.2雷帕霉素处理抑制m TORC1活性雷帕霉素可显著抑制p-p70S6K、p-4EBP1表达量,与6h组有统计学差异,说明雷帕霉素可完全抑制缺氧激活的m TORC1。3.3慢病毒干扰抑制m TORC1活性敲减了Raptor的细胞接受缺氧处理后p-p70S6K和p-4EBP1表达量无明显变化,p70S6K、4EBP1总蛋白表达水平不受缺氧及sh Raptor处理的影响,说明敲减Raptor可切实有效地抑制m TORC1活性。3.4 m TORC1失活抑制细胞运动性活细胞工作站结果显示,正常细胞的运动轨迹集中,轨迹速度较小,缺氧处理可促进细胞运动性。抑制m TORC1活性后,细胞的运动范围明显减小,轨迹速度降低,单个角质形成细胞的运动能力下降。划痕实验也可得到相似的结果。3.5缺氧处理抑制角质形成细胞AMPK通路缺氧3h、6h、12h后p-AMPK和p-ACC表达量显著下降,AMPK、ACC总蛋白表达水平不受缺氧处理的影响。Ha Ca T细胞接受缺氧处理后亦出现类似的现象。这些结果表明缺氧不影响AMPK的转录翻译表达,可显著抑制AMPK通路活性。3.6激活AMPK可抑制m TORC1活性Met、AICAR处理可引起p-AMPK、p-ACC表达水平明显升高,AMPK通路激活,p-p70S6K和p-4EBP1表达量显著下降,m TORC1被明显抑制,说明激活AMPK通路可抑制m TORC1。在Ha Ca T细胞中亦可得到一致结论。3.7激活AMPK可抑制细胞运动性活细胞工作站结果显示,缺氧处理可促进细胞运动性,细胞的运动范围、轨迹速度增加。加入Met和AICAR后,细胞的运动范围减小,轨迹集中,轨迹速度降低。在Ha Ca T细胞中亦可观察到一致的现象,说明激活AMPK会引起单个角质形成细胞的运动能力下降。划痕实验也可得到类似的结果。3.缺氧通过抑制AMPK激活m TORC1而促进细胞运动能力结论总结本课题,可得到以下结论:1.电场可引起角质形成细胞发生EMT转换,使细胞由静止状态转变为运动状态,促进细胞运动能力;这一过程是通过电场抑制PTEN从而激活m TORC1信号通路实现的。2.电场可引起角质形成细胞从正极向负极定向迁移,迁移速度增加,这一过程是通过自噬实现的。电场可引起自噬生成增加,细胞中溶酶体酸化正常,自噬体和溶酶体顺利融合,溶酶体可正常降解底物,自噬流通畅,不存在由于自噬流受损导致的自噬累积,下调细胞自噬水平不影响细胞运动的方向性,可显著抑制细胞定向迁移速度。3.缺氧可引起角质形成细胞中细胞运动能力显著增加,这一效应的原因是缺氧引起AMPK活性下降从而激活m TORC1通路。4.本课题研究了创面微环境(电场、缺氧)对创面修复过程中角质形成细胞启动和后续迁移的作用及分子机制,对揭示创面愈合规律有重要理论价值,也为临床创面治疗提供新的思路。