论文部分内容阅读
精子生成后，需要进一步在附睾中成熟和在雌性生殖道中获能，最终才能获得运动和受精能力。本文主要关注环境因素和基因对精子成熟和获能的影响。本文分两部分，第一部分，研究内分泌干扰化合物双酚A(BPA)对精子获能的影响及其分子机制。第二部分，研究附睾特异性基因Lcn6对精子成熟及生育的影响。 第一部分我们通过灌胃实验，对成年雄性大鼠进行不同浓度的BPA暴露，我们发现BPA高剂量组(200 mg/kg/d)大鼠的精子运动显著增加。利用体外实验，我们发现BPA能以剂量和时间依赖性明显促进精子获能相关的酪氨酸磷酸化。同时，体外受精(In VitroFertilization，IVF)实验表明，BPA能显著增加受精率。精子获能相关磷酸化是由sAC/cAMP/PKA通路调节的，且培养液中BSA，HCO3-和Ca2+是这种磷酸化所必需的。我们研究发现，BPA在分别缺失BSA，HCO3-，和Ca2+的培养液的情况下，仍然能促进精子获能相关的酪氨酸磷酸化。然而，这种促进作用能够被H89(蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)高度选择性抑制剂）所抑制;但不能被KH7(腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)特异的抑制剂）所抑制。最新研究发现，Src和Abl酪氨酸激酶家族在PKA调节的酪氨酸磷酸化中发挥重要角色。我们研究发现，Src酪氨酸激酶家族特异性的抑制剂SU6656不能阻断BPA诱导的酪氨酸磷酸化，而Abl激酶家族抑制剂Bosutinib能够阻断BPA的诱导效应。这些结果表明，BPA可激活PKA的活性进而通过Abl促进精子获能相关的酪氨酸磷酸化。 第二部分，通过建立Lcn6敲除小鼠模型，主要从精子成熟和生育两方面研究Lcn6的功能。结果显示，Lcn6缺失的小鼠精子在获能初始点运动精子百分数高于正常小鼠精子，但没有显著差异。随着体外获能时间的延长，Lcn6缺失的小鼠的运动精子百分数急剧下降，和对照组相比，具有显著差异。精子运动形式分析表明，Lcn6缺失的小鼠前向运动精子百分数在获能初始显著高于对照，但随着获能时间延长，其百分数急剧下降，显著低于对照组精子。Lcn6缺失的小鼠精子运动速度（包括VCL，VAP，VSL）获能初始都远远高于对照组，随着获能时间的延长与对照差异逐渐缩小。为了进一步检测分析Lcn6敲除对小鼠精子运动的影响机制，我们检测了精子细胞内钙离子浓度和ATP的浓度，结果发现，Lcn6缺失的小鼠精子细胞内钙离子浓度显著高于对照组;而ATP含量则在整个获能过程中（0-120分钟）都低于对照组，但这种差距随着获能时间的进行逐渐减少。通过WesternBlot检测，我们发现Lcn6缺失小鼠的精子和正常小鼠精子获能相关蛋白酪氨酸磷酸化相比，缺失了位于28-36KD之间的两条带。 基于上述Lcn6敲除小鼠精子表型改变，我们推测Lcn6可能会影响生育，为此我们做了交配实验。交配实验显示Lcn6缺失的小鼠生育力显著低于正常小鼠，杂合子的生育力介于两者之间。