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胰2白酶(Trypsin,EC3.4.21.4)是由胰腺分泌的碱性蛋白水解酶,属于丝氨酸蛋白酶(serine proteases)家族。本论文利用基因工程的方法得到重组人阴离子型胰蛋白酶。论文对可重组人阴离子型胰蛋白酶的培养条件,激活条件,纯化,部分性质及稳定性等进行了研究。同时对其在细胞培养和酶原激活方面的应用做了初步研究。
成功构建了rc-htryp的表达载体。通过培养条件优化,使rc-htryp的表达量得到提高。正交试验的方法确定培养条件为:温度15℃,IPTG浓度为1mmol/L,Ca2+浓度10mmol/L条件下得到的胰蛋白酶活力最高。研究发现上清液在pH8.0的Tris-HCl缓冲液加入1 mmol/L的Ca2+,3 U/mL的胰蛋白酶激活,4℃条件下激活24 h后得到有活性的胰蛋白酶。
对rc-htryp性质研究发现其最适温度及pH分别为30℃与pH7.6,温度高于40℃易失活。以BAEE为底物,Km和Vmax分别为12.7μmol/L和212.76μmol/min。EDTA与PMSF对酶活力影响非常大,在低浓度就能完全抑制rc-htryp的活性。Rc-htryp在激活羧肽酶原B速率上,要优于提取的牛胰蛋白酶(Sigma)。对鼠T3细胞的消化研究,发现同样活性条件下,消化速率比提取的牛胰蛋白酶(Sigma)高。
利用有机溶剂沉淀和低温冷冻干燥的方法得到了重组人胰蛋白rc-htryp固体粉末。对冻干过程中添加保护剂的种类和浓度进行筛选,发现5%山梨醇的效果最佳,可完全保持冻干过程中rc-htryp的活力。