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目的:观察蟾毒灵对高转移潜能肝癌细胞HCC-LM3增殖、粘附与侵袭作用以及对Hedgehog信号转导通路的影响;揭示蟾毒灵抗肝癌细胞增殖、侵袭与转移的分子机制。 方法: 1)体外培养高转移潜能人肝癌细胞HCC-LM3，依据实验要求分为DMEM对照组、5-FU组、蟾毒灵组、蟾毒灵+GANT61组、蟾毒灵+环巴胺组、蟾毒灵+GANT61+环巴胺组; 2)采用CCK方法检测不同浓度蟾毒灵对HCC-LM3的生长抑制作用，用流式细胞技术检测不同作用时间和浓度时蟾毒灵对HCC-LM3肝癌细胞增殖和凋亡的影响; 3)采用Transwell小室、FN黏附基质实验观察蟾毒灵对HCC-LM3肝癌细胞迁移、侵袭和黏附作用的影响; 4)采用Western Blotting技术检测蟾毒灵作用HCC-LM3肝癌细胞Hedgehog信号通路中相关蛋白以及与细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的变化; 5)采用Hedgehog信号通路阻断剂阻断该信号通路中关键蛋白后，观察蟾毒灵对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和黏附能力的影响; 6)采用Hedgehog信号通路阻断剂阻断该信号通路中关键蛋白后，观察蟾毒灵对肝癌细胞Hedgehog信号通路中相关蛋白以及与细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的变化。 结果: 1)不同浓度的蟾毒灵分别作用于HCC-LM3肝癌细胞24、48、72小时后，发现相同作用时间下，随着药物浓度的逐渐增加，蟾毒灵对肝癌细胞的抑制率逐渐增强（F=14.823，F=15.623，F=4.737，P＜0.05）;同一作用浓度下，随着作用时间延长，蟾毒灵对肝癌细胞的抑制率亦逐渐增加(F=44.757，4F=3.256，F=19.682，F=17.112，F=50.765，F=31.214，P＜0.05)。与5-FU相比，蟾毒灵对肝癌细胞抑制率较强。 2)蟾毒灵作用HCC-LM3肝癌细胞72小时的IC30（0.02μg/ml）、IC50(0.04μg/ml)、IC70(0.08μg/ml)分别低于5-FU的IC30（1.05μg/ml）、IC50(12.34μg/ml)、IC70(25.79μg/ml)，72小时IC50差异具有统计学意义（t=-6.606，P＜0.05）。表明相同作用时间内蟾毒灵抑制肝癌细胞生长作用强于5-FU。 3)蟾毒灵将HCC-LM3肝癌细胞增殖周期阻滞于G2期和S期，从而诱导肝癌细胞凋亡。与5-FU相比，蟾毒灵抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡较强。72小时G2+S期蟾毒灵IC50组百分比高于5FU IC50组，二者之间差异有统计学意义(t=-4.153，PP＜0.05)。24小时蟾毒灵IC50组与5FU IC50组的凋亡率差异无统计学意义（t=-0.394，P＞0.05），48、72小时蟾毒灵IC50组的凋亡率均高于5FU IC50组，差异具有显著统计学意义（t=-4.329，P＜0.05;t=-4.418，P＜0.05）。随着蟾毒灵药物浓度增加和作用时间的延长，细胞间排列稀疏，肝癌细胞形态失去极性，细胞贴壁能力下降，细胞变圆、皱缩，胞质密度稀疏，胞浆颗粒增多、空泡变性，胞核可见散在颗粒状物质，存活细胞数量逐渐减少，死亡细胞增多。表明蟾毒灵抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡作用具有时间——剂量双重依赖性。 4)蟾毒灵显著抑制HCC-LM3肝癌细胞迁移、侵袭和黏附能力，抑制作用强于5-FU，且抑制作用呈剂量依赖性（t=3.165，F=5.515，F=4.366，P＜0.05）。 5)蟾毒灵对HCC-LM3肝癌细胞Hedgehog信号通路中SHH蛋白表达无显著影响（F=0.612，P＞0.05）;蟾毒灵显著抑制肝癌细胞Ptch1、Gli1、Gli3蛋白表达，且抑制作用呈时间依赖性（F=3.646，F=16.124，F=8.037，P＜0.05）。与5-FU相比，蟾毒灵对肝癌细胞SHH和Ptch1蛋白表达无显著性差异（F=0.612，P＞0.05;F=3.646，P＞0.05），但对肝癌细胞Gli1和Gli3蛋白表达抑制作用显著增强(F=16.124, F=8.037, P＜0.05) 6)蟾毒灵显著抑制肝癌细胞β-catenin、MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达，上调肝癌细胞E-cadherin蛋白表达，且抑制作用呈时间依赖性，抑制或上调作用强于5-Fu(F=22.145,F=32.993,F=11.858,F=25.864,F=32.298,P＜0.05)。 7)分别阻断Hedgehog信号通路中关键蛋白Gli1或Smo后，蟾毒灵抑制HCC-LM3肝癌细胞生长和诱导凋亡作用增强，尤以阻断Smo蛋白后蟾毒灵的抑制作用更强（F=27.777、29.782、110.696，P＜0.05）;阻断Gli1或Smo后对蟾毒灵阻滞肝癌细胞增殖周期影响无明显差异(F=29.782，P＞0.05)。联合抑制Gli1和Smo蛋白表达后，蟾毒灵抑制肝癌细胞生长、阻滞细胞周期以及诱导细胞凋亡的作用最强(F=27.777、29.782、110.696, P＜0.05)。 8)阻断Hedgehog信号通路关键蛋白Gli1或Smo后，蟾毒灵抑制HCC-LM3肝癌细胞迁移、侵袭和黏附能力增强，且两种蛋白同时阻断时抑制作用最强(F=181.230、15.694、48.636, P＜0.05)。 9)阻断Hedgehog信号通路中关键分子Gli1或Smo蛋白，蟾毒灵对肝癌细胞SHH蛋白表达无显著影响(F=0.309，P＞0.05)，阻断Gli1蛋白表达后蟾毒灵对肝癌细胞Ptch1表达差异无统计学意义(F=68.736，P＞0.05)，而阻断Smo蛋白表达后蟾毒灵显著抑制肝癌细胞Ptch1表达(F=68.736，P＜0.05)。 10)阻断Hedgehog信号通路Gli1或Smo蛋白后，显著增强蟾毒灵抑制肝癌细胞Gli1表达(F=7.475，P＜0.05);阻断Smo蛋白表达后，蟾毒灵显著抑制肝癌细胞Gli3表达，而阻断Gli1表达蟾毒灵对肝癌细胞Gli3表达影响无统计学差异(F=20.761，P＞0.05)。 11)阻断Hedgehog信号通路Gli1或Smo蛋白后，显著增强蟾毒灵抑制肝癌细胞β-catenin表达，上调肝癌细胞E-cadherin表达，但与阻断部位无关(F=19.149、F=19.348，P＜0.05)。 12)阻断Hedgehog信号通路Gli1或Smo蛋白后，显著增强蟾毒灵抑制肝癌细胞MMP-2、MMP-9和VEGF表达，尤其阻断Gli1后对肝癌细胞MMP-2、MMP-9和VEGF表达抑制作用强于阻断Smo（F=10.913，F=93.588，F=28.787，P＜0.05）。 结论: 1)蟾毒灵可阻滞HCC-LM3肝癌细胞增殖于S期和G2期，诱导肝癌细胞凋亡，显著抑制肝癌细胞增殖，同时抑制HCC-LM3肝癌细胞迁移、侵袭和黏附，从而影响肝癌细胞的侵袭转移能力。 2)蟾毒灵可能通过靶向干扰Hedgehog信号通路中关键分子的表达，调控肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移，显著增强蟾毒灵抗肝细胞癌作用。