【摘 要】
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目的:通过从小鼠血管纹中获得耳蜗血管周常驻巨噬细胞（PVMs）细胞系,建立氯化钴（CoCl2）模拟缺氧模型,研究色素上皮衍生因子（PEDF）在PVMs缺氧损伤中的作用。方法:将出生10-15天的C57BL/6小鼠血管纹外植体在生长培养基中选择性培养获得原代PVMs细胞系并用流式细胞术对其进行纯化。通过免疫荧光染色和逆转录多聚酶联反应（RT-PCR）验证PVMs表型和基因型。用CoCl2建立缺氧模型
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目的:通过从小鼠血管纹中获得耳蜗血管周常驻巨噬细胞（PVMs）细胞系,建立氯化钴（CoCl2）模拟缺氧模型,研究色素上皮衍生因子（PEDF）在PVMs缺氧损伤中的作用。方法:将出生10-15天的C57BL/6小鼠血管纹外植体在生长培养基中选择性培养获得原代PVMs细胞系并用流式细胞术对其进行纯化。通过免疫荧光染色和逆转录多聚酶联反应（RT-PCR）验证PVMs表型和基因型。用CoCl2建立缺氧模型,细胞活力检测试剂盒（CCK-8）检测细胞活力,确定CoCl2模拟缺氧环境的最适浓度。用3-5代原代培养PVMs进行试验。酶联免疫吸附（Elisa）检测PVMs培养基中PEDF的含量及常氧和缺氧环境中PVMs培养基中PEDF含量的差别。并检测PEDF对缺氧环境中PVMs凋亡的影响,确定PEDF对缺氧环境中PVMs的作用。结果:通过细胞培养基从10-15天小鼠耳蜗血管纹选择性获取PVMs并通过流式细胞术纯化可获得纯>90%的PVMs。PVMs表型和形态学验证:免疫染色显示F4/80（红色）、Phalloidin（绿色）和细胞核（蓝色）,PVMs具有独特的树突状突起。基因鉴定PVMs在F4/80、GST和GSTα4在各自多聚酶联反应产物分子量区域显示明显条带。CCK-8检测细胞活力结果显示CoCl2模拟缺氧的最适浓度为250u M。Elisa结果显示含PVMs的巨噬细胞培养基中PEDF含量增多,缺氧条件下PVMs分泌PEDF含量较常氧条件下增多。流式细胞术检测显示CoCl2模拟的缺氧环境中,可见PVMs细胞凋亡,PEDF在缺氧环境中可以使PVMs的凋亡减少。结论:运用该方法可以从耳蜗血管纹培养出高质量的PVMs细胞,PVMs细胞分泌PEDF,在缺氧环境下PEDF分泌增多,CoCl2可以模拟细胞内缺氧环境,其最适浓度为250u M,且PEDF对CoCl2诱导的缺氧损伤具有保护作用。
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