论文部分内容阅读
脊髓灰质炎(Poliomyelitis,以下简称脊灰)是由脊髓灰质炎病毒(Poliomyelitis Virus, PV)感染引起、危害极大的急性传染病,尚无有效治疗方法,只能通过疫苗预防。口服脊灰减毒活疫苗(Oral Poliomyelitis Vaccine, OPV)因接种方便,成本相对较低而一度被广泛使用,但可能引起脊灰疫苗相关麻痹病例(Vaccine-Associated Paralytic Poliomyelitis, VAPP)和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-Derived Poliovirus, VDPV)病例,灭活脊灰疫苗(Inactivated poliomyelitis vaccine, IPV)能有效避免VAPP和VDPV,采用IPV取代OPV是《全球消灭脊灰战略终结计划》的要求。而在全世界消灭脊灰后,采用野毒株(Salk)生产IPV对生物安全水平要求更加严格,因此WHO鼓励疫苗厂家研发Sabin株脊灰灭活疫苗(Inactivated Poliomyelitis Vaccine, Sabin strain, sIPV)o在研发sIPV过程中,Sabin株毒种的遗传稳定性极其重要。本研究通过检测PV感染性滴度、D抗原含量以及PV全基因组Sanger测序的方法来检测制备的工作种子和疫苗代次病毒的遗传稳定性。此外,生产中在对疫苗质量进行监测时,需区别通过和未通过猴体神经毒力试验(Monkeys Neurovirulence Test, MNVT)的疫苗之间的差别；而采用聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术作突变分析(Mutant Analysis by PCR and Restriction Enzyme Cleavage, MAPREC)虽然可以准确地测定出一个碱基位点突变的量,但无法实现对基因组每个核苷酸的序列变化都进行监测。随着分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善,第二代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS)的出现,使得基因检测效率不断提高,从分子水平来监测疫苗质量更容易实现。本研究通过对Sabin株病毒NGS模板制备方法的讨论,探讨了如何去除背景核酸的干扰、低浓度样品的扩增方法选择、样品的纯化定量筛选以及质量鉴定,以及测序平台的选择等问题。目的1.分析sIPV毒种(亚主种子、工作种子)及疫苗代次病毒(SO+4)、SO+5、SO+6的遗传稳定性；2.初步建立Sabin株病毒NGS样品的预处理方法、扩增方法、纯化筛选方法以及测序平台选择等问题,以期为进一步研究Sabin株的遗传稳定性构建一种切实可行的新方法。方法1.比较疫苗株Sabin Ⅰ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的感染性滴度及D抗原含量的变化情况,并对上述病毒进行全基因组测序；2.采用常用的NGS样品的预处理方法、扩增方法、纯化等方法制备Sabin株病毒NGS测序模板,比较筛选适用Sabin株病毒NGS的最佳组合,并对制备的模板进行定量和质量鉴定。结果1.各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62～8.62 1gCCID50/ml,D抗原含量均维持在30～128 DU/ml.与GenBank上登录的Sabin Ⅰ (AY184219.1)、Ⅱ型(AY184220.1)及Sabin Ⅲ型(AY184221.1)减毒株原始种子(SO)基因序列相比,Sabin株亚主种子(S0+2)、工作种子(S0+3)及疫苗代次病毒(S0+4)、SO+5、SO+6均未出现碱基突变；2. Sabin株病毒NGS模板制备的样品预处理是必要的,选用不依赖序列的单引物扩增效果最好,优化了磁珠纯化法的磁珠用量,且采用Qubit定量系统定量更精确。结论1.sIPV毒种及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的病毒全基因序列与原始种子相比,均未发生变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性；2.初步建立了Sabin株病毒NGS的模板制备方法,并成功制备了Sabin株病毒NGS模板。