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乳酸菌(Lactic acid bacteria)大多是益生菌,是现阶段研究较多的一类工程菌株。由于食品工业中使用的乳酸菌一般被认为是安全的,因而研究与开发乳酸菌食品级载体-受体系统,探索重要基因在乳酸菌中的克隆表达,已成为乳酸菌分子生物学研究的热点。本文从发酵食品中乳酸菌的分离出发,进而从中提取高纯度的质粒,选择合适的质粒进行序列测定与分析,并对乳酸菌质粒与宿主的匹配能力进行研究。本文首先从泡菜和酸奶中共分离得到8株乳酸菌菌株,其革兰氏染色均为阳性,无芽孢,接触酶检验为阴性,兼性厌氧,能够在5%的CO2条件下生长,代谢产物中有乳酸,能够将溴甲酚紫变成黄色,不产气,并能够耐盐生长。经16S rDNA鉴定,其中6株为植物乳杆菌,2株为嗜热链球菌。对乳酸菌天然质粒的提取方法进行研究,发现与方法一(O’Sullivan等建立的方法)、方法二(乳酸菌的收集和裂解按O’Sullivan等建立的方法进行,质粒的抽提和回收按照大肠杆菌质粒提取方法进行)相比,采用方法三(菌体裂解前用溶菌酶处理,再使用北京TIANGEN质粒提取试剂盒进行质粒的提取)得到的质粒条带更为清晰、明亮,提取效果更好。对方法三作进一步优化,确定提取过程中溶菌酶的最佳浓度为20mg/mL,最佳处理时间为30min,同时避免了毒性物质溴化乙锭的使用。分别从5株乳酸菌中进行了质粒的提取,并选择实验室从泡菜中分离的植物乳杆菌S1中提取的2 kb左右的质粒pLPS1作为研究对象,对pLPS1进行了测序,用生物信息学方法对其序列进行了分析研究。该质粒基因全长2117bp,G+C含量为38.03%。从267~1448bp为开放阅读框ORF1,共编码393个氨基酸。编码蛋白质的理论分子量为44.3kDa。对编码蛋白质的二级结构进行预测,其中α-螺旋结构占总蛋白量的44.27%,延展链占7.38%,β-转角占4.58%,不规则卷曲占43.77%。蛋白序列的N端存在一个20个氨基酸左右的疏水区,经分析表明其具有信号肽功能。对质粒pMG36e的电转化条件进行了研究。以植物乳杆菌CGMCC1.555为宿主菌,其转化最佳条件为:工作电压2.25kV,甘氨酸浓度2.95%,培养时间3.96h,在此条件下,电转化效率达到预测最大值1909cfu/μg DNA;以乳酸乳球菌乳亚种CICC 6060为宿主菌时,电转化的最佳条件为:工作电压2.38kV,甘氨酸浓度2.68%,培养时间6.19h,在此条件下,电转化效率达到预测最大值1375cfu/μg DNA。