论文部分内容阅读
研究背景肝癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。原发性肝癌是从肝上皮或间质组织中发生的,主要为肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)。由于早期症状不明显且缺少筛查标记物,肝癌发展迅速,导致患者预后较差。肝癌的发生发展是一个复杂的过程,其病因尚未完全阐明。已知的肝癌环境致病因素包括慢性乙肝病毒、甲肝病毒感染、黄曲霉毒素摄入和酒精滥用等因素。在人类基因组中,只有小部分DNA序列为编码基因,可以被转录并翻译成蛋白质;但大部分DNA序列被活跃转录为非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)。非编码DNA序列约占人类基因组的90%,其转录产生的ncRNA在人类生命活动中发挥了重要调节作用。在ncRNA大家族中,长度大于200个核苷酸的ncRNA被称为长链非编码RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)。lncRNA参与调控多种生物学过程和信号通路,与多种人类复杂疾病的发生发展密切相关。除了少量lncRNA外,大多数人类lncRNA在肝癌发生发展中的功能仍未知,需要进一步研究揭示。WDR11位于人类染色体10q25-26,在髓母细胞瘤中发挥抑癌功能。WDR11-AS1是位于WDR11启动子区上游的一个反向转录的lncRNA基因。目前,尚不清楚lncRNA WDR11-AS1和WDR11在肝癌发生发展中的功能及其表达调控机制。基于此,本研究针对上述科学问题展开研究。研究方法1.检测lncRNA WDR11-AS1和WDR11在肝癌组织中的表达情况收集25对来自于山东省肿瘤医院肝癌患者的手术切除癌组织及正常组织,提取组织总RNA,利用RT-qPCR检测lncRNA WDR11-AS1和WDR11表达水平,进而分析lncRNA WDR11-AS1和WDR11表达相关性。2.揭示lncRNA WDR11-AS1和WDR11对肝癌细胞表型的影响(1)利用细胞计数实验检测lncRNA WDR11-AS1和WDR11对肝癌细胞增殖能力的影响。(2)利用划痕实验和Transwell侵袭实验检测lncRNA WDR11-AS1和WDR11对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。3.研究lncRNA WDR11-AS1和WDR11抑制肝癌发生发展的机制(1)明确在肝癌细胞中lncRNA WDR11-AS1和WDR11二者之间的表达调控关系。(2)检测lncRNA WDR11-AS1的亚细胞定位。(3)利用RNA pulldown实验、质谱分析和RNA-蛋白免疫共沉淀实验(RIP)发现lncRNA WDR11-AS1的结合蛋白,并利用Western Blot进行验证。(4)揭示lncRNAWDR11-AS1对PARP1蛋白泛素化修饰及降解的影响。4.动物实验利用肝癌SK-Hep-1细胞系构建裸鼠移植瘤,将裸鼠随机分为三个实验组(对照组、lncRNAWDR11-AS1组、WDR11组),对裸鼠移植瘤生长情况进行观察记录,统计学分析lncRNA WDR11-AS1和WDR11对小鼠移植瘤增殖的影响。研究结果1.lncRNA PWDR1-AS1和WDR11在肝癌组织中低表达,在肝癌组织和正常组织中lncRNA WDR11-AS1和WDR11的表达呈显著正相关。2.lncRNA WDR11-AS1和WDR11对肝癌细胞表型的影响(1)细胞增殖实验结果显示:与对照组相比,过表达lncRNA WDR11-AS1和WDR11能够明显抑制肝癌细胞增殖。(2)划痕实验和Transwell实验结果显示:过表达lncRNA WDR11-AS1和WDR11能够显著的抑制肝癌细胞的侵袭和转移。3.lncRNA WDR11-AS1和WDR11抑制肝癌发生发展的机制(1)在肝癌细胞中,WDR11转录调控lncRNAWDR11-AS1的表达。(2)对核质分离实验的产物进行RT-qPCR检测发现lncRNA WDR11-AS1在肝癌细胞核和细胞质中均有分布。(3)RNApulldown产物通过质谱分析及后续的RIP实验结果证实lncRNA WDR11-AS1在肝癌细胞中与PARP1蛋白结合。(4)lncRNAWDR11-AS1促进PARP1蛋白的泛素化降解。4.过表达lncRNA WDR11-AS1和WDR11显著抑制裸鼠移植瘤生长。研究结论1.lncRNA WDR11-AS1和WDR11在肝癌组织中低表达。2.肝癌组织中WDR11与lncRNAWDR11-AS1的表达呈正相关。3.lncRNA WDR11-AS1和WDR11显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭转移能力。4.lncRNA WDR11-AS1与PARP1蛋白直接结合并促进其后者通过泛素蛋白酶体途径降解。