多胺衍生物的合成及其示踪胰腺癌的相关实验研究

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目的:在细胞水平及荷瘤裸鼠模型上评价多胺衍生物示踪胰腺癌的能力以及二氟甲基鸟氨酸(difluoro methyl ornithine,DFMO)对多胺衍生物进入胰腺癌细胞的辅助作用。本研究旨在为多胺衍生物及DFMO在胰腺癌诊断及治疗中提供新的思路,为后续基于多胺衍生物的抗胰腺癌药物的开发提供理论基础。方法:(1)化学合成带有荧光结构的多胺衍生物:异硫氰酸荧光素-腐胺衍生物(F1)及4-二甲氨基-1,8-萘二甲酰亚胺-精胺衍生物(N2),并以核磁共振波谱表征。(2)紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法检测上述化合物的紫外吸收光谱、发射和激发光谱。(3)MTT法评价DFMO及N2对胰腺癌细胞系PANC-1、人正常胰腺导管上皮细胞h TERT-HPNE细胞的毒性作用。(4)细胞荧光技术分析PANC-1细胞对F1、N2的摄取情况,及DFMO对摄取过程的辅助作用。(5)流式细胞术定量分析不同浓度DFMO作用下N2进入胰腺癌PANC-1细胞荧光强度变化。(6)小动物活体成像技术检测N2对胰腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤示踪作用。(7)冰冻切片技术检测N2在胰腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织及重要脏器内的分布情况。结果:(1)成功合成异硫氰酸荧光素-腐胺衍生物(F1)、4-二甲氨基-1,8-萘二甲酰亚胺-精胺衍生物(N2)及其中间体4-二甲氨基-1,8-萘二甲酸酐(N1),N1即N2不带精胺可发荧光的母核结构。上述三种化合物均可发绿色荧光。(2)F1的最大激发波长为494nm,最大发射波长为517nm;N2的最大激发波长分别为421nm,最大发射波长分别为532、538nm,N1的光谱特性与之接近。确定了用于后续实验的激发、发射波长范围。(3)DFMO、N2分别作用PANC-1细胞、h TERT-HPNE细胞(正常对照细胞)24小时后,当DFMO浓度小于10mmol·L-1、4-二甲氨基-1,8-萘二甲酰亚胺-精胺衍生物浓度小于10μmol·L-1时对两种细胞毒性极小。(4)细胞荧光实验表明:F1进入PANC-1细胞效率低下;N2可高效进入PANC-1细胞,而进入正常胰腺导管上皮细胞h TERT-HPNE细胞效率低下,且母核N1进入PANC-1细胞效率极低;DFMO作用于PANC-1细胞12小时后,随DFMO浓度的增加PANC-1细胞对N2的摄取能力增强。(5)流式细胞术结果表明:在一定范围内提高DFMO浓度,DFMO作用于PANC-1细胞12小时后细胞内荧光强度增加;在无DFMO作用PANC-1细胞时,随着N2浓度增加荧光强度呈先上升继而强度不变,呈现饱和趋势。(6)小动物活体成像结果显示:由于N2的激发、发射波长均较短,组织穿透力较弱且难以与裸鼠自身背景荧光分离,体内实验需进一步优化该精胺衍生物的结构。(7)冰冻切片结果表明:N2在肿瘤组织中主要分布于细胞内,在重要脏器组织内主要分布于间质而在肾脏、肺脏中少量分布于实质细胞中。结论:合成的精胺衍生物(N2)可通过胰腺癌细胞膜上高表达的PTS而富集到胰腺癌细胞内进而示踪胰腺癌,DFMO能够促进胰腺癌细胞对精胺衍生物的摄取。以上结论为多胺衍生物及DFMO在胰腺癌的诊断及靶向治疗方面的研究提供了新思路,为后续基于胰腺癌的诊断和治疗提供了理论基础。
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