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目的:
近十年来，通过生物学预测和计算机分析、基因芯片筛查以及高通量测序等手段，在细菌基因组内已经发现了一批非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)，它们作为基因表达的调控因子，在细菌中发挥重要作用。AsrC为本实验室在伤寒沙门菌中新发现的ncRNA，其基因位于rseC的互补链，本论文拟研究该非编码RNA在伤寒沙门菌中的相关功能。
方法:
1.伤寒沙门菌AsrC高表达菌株的构建。根据Northern鉴定出的AsrC，以及5’和3RACE（末端快速扩增技术）找到的转录起始及终止位点，从前期测序中找到该段全长序列。在5’起始端上游140bp处和3’终止端处分别设计上下游引物，扩增获得目的片段，经NcoⅠ和HindⅢ双酶切，与同样酶切后的低拷贝质粒pBAD/Myc-HisA定向连接，并克隆至大肠埃希菌TOP10。经PCR、酶切验证和测序分析鉴定后，将阳性重组质粒和空质粒分别电击导入伤寒沙门菌野生株，作为AsrC高表达菌株和空质粒对照株。
2.AsrC高表达菌株在不同条件下的生长曲线测定。以生长时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线，对比AsrC高表达菌株和空质粒对照株在正常及酸、氧、高渗应激条件下的生长情况。
3.AsrC高表达菌株的基因表达谱分析。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD6000.4)，加入0.2％(w/v)的阿拉伯糖诱导1h后分别提取总RNA，反转录为cDNA并配对互标荧光素cy3和cy5，利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，与基因组芯片杂交，扫描后将荧光信号数据化，分析比较伤寒沙门菌AsrC高表达菌株和空质粒对照株的基因表达谱差异。
4.AsrC高表达菌株的动力实验。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD6000.4)后加入0.2％(w/v)的阿拉伯糖诱导1h，分别取野生株、asrC启动子缺失株、AsrC高表达菌株和空质粒对照株的2.5μl菌液点种于0.3％的等渗半固体LB培养基，37℃培养8h后测量动力圈直径，两两比较细菌的动力。
5.AsrC高表达菌株的上皮细胞侵袭实验。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD6000.4)，在0.2％（w/v）的阿拉伯糖诱导1h后，分别把野生株、asrC启动子缺失株、AsrC高表达菌株和空质粒对照株加入培养有HeLa细胞的24孔板中（MOI均为20）。培养90min后将部分孔的细胞破膜，收集菌体后涂板过夜，菌落数代表细菌粘附细胞水平(T0);另一部分孔的细胞加入庆大霉素继续培养90min后，破膜涂板过夜，菌落数代表细菌侵袭水平(T90)，以T90/T0值代表细菌的侵袭力。
6.AsrC高表达菌株在THP-1细胞内生存实验。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD6000.4)，在0.2％(w/v)的阿拉伯糖诱导1h后，分别把野生株、asrC启动子缺失株、AsrC高表达菌株和空质粒对照株加入培养有THP-1细胞的24孔板中（MOI均为10）。培养1h后加入庆大霉素，再作用1h后将部分孔的细胞破膜，收集菌体后涂板过夜，计菌落数(T0)表示基础细菌吞噬水平;另一部分孔的细胞继续培养12或24h，破膜后涂板过夜，菌落数(T12或T24)代表胞内细菌增殖水平，T12/T0和T24/T0表示细菌在THP-1细胞内生存力。
7.qRT-PCR对伤寒沙门菌rseCmRNA的稳定性分析。将AsrC高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD6000.4)，不加或加入0.2％（w/v）的阿拉伯糖继续培养5、10、20min，以TRIzol提取总RNA后进行逆转录及qRT-PCR，分析rseCmRNA的水平变化趋势。
结果:
1.经酶切验证和测序分析鉴定，成功构建pBAD-asrC阳性重组载体，并将该1034bp的asrC高表达片段导入野生株GIFU10007，表明伤寒沙门菌AsrC高表达菌株制备成功。
2.生长曲线表明，在正常及酸、氧、高渗应激条件下，AsrC高表达菌株和空质粒对照株并无明显差异。
3.基因芯片结果显示，高表达AsrC后，有41个基因表达上调，主要涉及鞭毛、侵袭和代谢相关基因;有23个基因表达下调，主要为代谢相关基因。
4.动力实验表明，asrC启动子缺失株的动力比野生株有所下降，而AsrC高表达菌株的动力较空质粒对照株明显升高。
5.与野生株相比，asrC启动子缺失株对上皮细胞的侵袭力有所降低，而高表达AsrC后的菌株在侵袭力上较空质粒对照株有明显提高。
6.与野生株相比，asrC启动子缺失株在THP-1细胞内的生存能力无明显变化，而高表达AsrC后的菌株在生存能力上较空质粒对照株有所下降。
7.qRT-PCR结果显示，AsrC的高表达可以提高rseCmRNA的稳定性。
结论:
伤寒沙门菌的非编码反义RNAAsrC在高表达后，对细菌在正常及酸、氧、高渗应激条件下的生长无明显影响;但其可影响细菌的动力、侵袭力及胞内生存力;同时其可增强rseCmRNA的稳定性。