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EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种双链DNA病毒,可持续性潜伏感染于宿主细胞内,其感染与多种人类肿瘤发生有关。90%以上的健康成人在3~5岁幼儿时期曾感染EBV,并且体内均可以检测到EBV抗体。EBV相关胃癌(EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC)是一种发病人数较高的EBV相关肿瘤,但其发病机制尚未明了。内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是内皮素家族成员之一,目前研究表明ET-1在大多数肿瘤组织中表达水平升高,具有促进细胞增殖、细胞迁移和侵袭、抑制细胞凋亡以及诱导上皮间质转化等多种生物学活性,在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。ET-1及其受体ETAR与病毒感染密切相关,如在HIV、HPV感染相关疾病具有独特的ET-1/ETAR mRNA和蛋白表达图谱。FOXO1既是ET-1的转录激活因子,又是PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK通路的下游效应分子;改变FOXO1的表达或使其磷酸化失活转运出核后降解,可以影响ET-1的表达,进而影响ET-1/ETAR激活后引起的级联反应。目的:明确ET-1/ETAR激活在EBVaGC发生发展中的作用,并探讨EBVaGC中EBV对ET-1/ETAR表达的影响以及可能的作用机制,为进一步明确EBVaGC发生发展机制提供实验基础。材料和方法:(1)实时荧光定量PCR检测EBVaGC(GT38,GT39,SNU719)和EBV阴性胃癌细胞系(EBVnGC:BGC823,HGC27,SGC7901,MKN45,AGS)中ET-1轴及相关microRNA的表达。(2)CCK8、Transwell和流式细胞分析检测ET-1/ETAR激活或抑制对细胞表型的影响。(3)亚硫酸氢盐基因组测序法检测ET-1基因启动子和第1外显子甲基化状态。(4)Western blot检测细胞系中ET-1及相关基因的蛋白表达;免疫组化检测胃癌组织中ET-1和ERK1/2蛋白表达。(5)免疫荧光检测胃癌细胞系中ERK1/2的亚细胞定位。(6)PI3K抑制剂LY294002和MEK抑制剂PD0325901处理细胞,检测ET-1蛋白表达的变化。(7)在SGC7901中过表达LMP1、LMP2A,检测ET-1蛋白水平的变化。(8)在EBV阳性胃癌细胞系GT39转染靶向沉默LMP1基因的siLMP1,在EBV阴性细胞系SGC7901和BGC823转染靶向沉默FOXO1基因的siFOXO1,检测ET-1蛋白水平的变化。(9)采用ETAR特异性阻断剂BQ123处理EBV阳性胃癌细胞系GT39和GT38,提取作用不同作用剂量和不同作用时间的蛋白,检测LMP1表达的变化。结果:(1)EBV阳性胃癌细胞系中ET-1mRNA和蛋白表达水平均低于EBV阴性胃癌细胞系(P<0.05);ETAR mRNA则明显高于EBV阴性胃癌细胞系(P<0.05),两种细胞系中蛋白表达水平无明显差异;ET-1在EBVnGC组织中表达水平较高,且与淋巴结转移呈正相关。(2)ET-1/ETAR激活可促进细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡。(3)两种细胞系中ET-1基因启动子和第一外显子均呈现低甲基化状态,且miRNAs(-1、-125a、-125b)的表达也无明显差异。(4)PI3K/AKT/FOXO1通路在EBVaGC呈激活状态,RAS/MEK/ERK通路则在EBVaGC中失活。(5)免疫荧光结果显示ERK1/2在EBV阳性胃癌细胞系主要分布在胞浆中,而在EBV阴性胃癌细胞系则主要定位于细胞核内;EBVnGC组织中ERK1/2激活更为明显(P<0.05),且与发病年龄显著相关(P<0.05)。(6)PI3K抑制剂LY294002可通过上调FOXO1促进ET-1表达,MEK抑制剂PD0325901可通过抑制FOXO1下调ET-1表达。(7)转染siFOXO1可导致ET-1蛋白水平下调。(8)干扰LMP1可以促进ET-1表达,而抑制ETAR蛋白生成。(9)过表达LMP1可使RAS/RAF/MEK/ERK通路失活,导致ET-1表达下调;过表达LMP2A可诱导RAS/RAF/MEK/ERK通路激活,使ET-1表达上调。(10)BQ123可以显著抑制LMP1蛋白的表达(P<0.05)。结论:(1)ET-1在EBV阳性胃癌中表达水平较高,ET-1/ETAR轴的激活可促进细胞增殖、迁移以及拮抗顺铂诱导的细胞凋亡。(2)EBVaGC中PI3K/AKT途径的激活可抑制FOXO1表达,进而可以阻断ET-1基因的转录表达;EBVaGC中RAS/MEK/ERK通路的失活可通过抑制FOXO1表达降低ET-1的表达。(3)EBV通过PI3K/AKT通路和RAS/MEK/ERK通路调控FOXO1的表达,进而影响ET-1的表达。