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研究目的:多药耐药是肝癌化疗失败的重要原因。迄今已经发展了三代肿瘤多药耐药逆转剂,因其疗效差、毒副作用大导致临床试验失败。因此,寻找新型先导化合物克服耐药型肝癌成为研究的热点。本课题组前期研究发现23-羟基白桦酸衍生物B5G1体外能杀伤多种肿瘤细胞,在此基础上本课题将进一步研究B5G1对多药耐药性肝癌细胞的生长抑制作用,并深入揭示其作用机制,为多药耐药型肝癌的治疗提供新型先导化合物。研究方法:(1)采用MTT实验和克隆形成实验分别检测B5G1对耐药性肝癌细胞株Hep G2/ADM的增殖抑制活性。(2)采用Annexin V-FITC/PI双染实验检测B5G1对Hep G2/ADM细胞凋亡的影响。(3)运用GFP-LC3转染、LC3免疫荧光和MDC染色实验观察B5G1诱导Hep G2/ADM细胞自噬小体的形成。(4)采用透射电镜观察B5G1处理后Hep G2/ADM细胞内自噬体和线粒体的超微结构。(5)采用Mitotracker染色实验检测B5G1对Hep G2/ADM细胞线粒体数量和形态的影响。(6)Mitotracker染色和LC3、p62或LAMP1免疫荧光实验以及mt-Keima荧光实验检测B5G1对Hep G2/ADM细胞线粒体与自噬体或溶酶体共定位的影响。(7)Western blot检测B5G1对Hep G2/ADM细胞凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、PARP和Cytochrome c,自噬相关蛋白LC3B、p62、Atg5和Beclin-1,线粒体相关蛋白COX IV、TOM20、Mfn2、Parkin和PINK1的表达水平的影响。(8)采用si RNA检测敲低Atg5、Beclin-1和parkin对B5G1诱导线粒体自噬的影响。(9)JC-1染色检测B5G1对Hep G2/ADM细胞线粒体膜电位的影响。(10)Mito SOX red染色检测B5G1对细胞内线粒体ROS含量的影响。研究结果:(1)B5G1对Hep G2/ADM肝癌耐药细胞株增殖具有显著的抑制作用,呈剂量和时间依赖性;且维拉帕米对B5G1的体外抗肿瘤活性无明显影响,表明B5G1不是P-gp的底物。(2)B5G1诱导线粒体Cytochrome c释放以及Caspase-9、Caspase-3和PARP剪切活化,启动线粒体凋亡途径。(3)B5G1诱导Hep G2/ADM细胞自噬小体和LC3累积。(4)B5G1诱导线粒体数量降低,线粒体膜蛋白COX IV、TOM20以及Mfn2表达下调,以及线粒体与LC3和LAMP1共定位,表明线粒体自噬的发生。(5)B5G1对Atg5和Beclin-1的表达水平无影响,敲低Atg5和Beclin-1不影响线粒体和LC3以及Lysotracker的共定位,提示B5G1诱导的线粒体自噬不依赖于Atg5和Beclin-1。(6)B5G1上调PINK1表达水平,诱导Parkin转位至线粒体,磷酸化Parkin表达升高,p62与线粒体共定位增加,启动线粒体自噬。敲低parkin抑制B5G1诱导的线粒体自噬。(7)B5G1通过诱导线粒体ROS水平升高,导致线粒体损伤和线粒体膜电位下降从而启动线粒体自噬。抗氧化剂NAC通过抑制ROS释放,逆转线粒体膜电位的降低,抑制B5G1导致的线粒体自噬和细胞凋亡,表明ROS是线粒体自噬和细胞凋亡的重要启动因素。(8)线粒体分裂抑制剂Mdivi-1以及敲低parkin促进B5G1诱导的Hep G2/ADM细胞凋亡,表明其诱导的细胞线粒体自噬是一种保护性机制。研究结论:B5G1对耐药性肝癌细胞Hep G2/ADM具有显著的体外生长抑制作用。B5G1诱导线粒体ROS释放,损伤线粒体,进而启动线粒体途径介导的Hep G2/ADM细胞凋亡;同时B5G1也诱导PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬,抑制线粒体自噬能增强B5G1的抗肿瘤活性。