论文部分内容阅读
目的:吗啡依赖是以失去控制力、强迫性连续用药为特征的慢性复发性脑疾病,对中枢神经系统造成严重损害。中脑多巴胺能系统在吗啡依赖引发的神经系统病理性改变及奖赏效应中起着至关重要的作用,其中中脑腹侧被盖区(Ventral tegmental area,VTA)及它的神经投射区域伏隔核(Nucleus accumbens,NAc),是两个重要的神经调节核团,目前关于不同时程吗啡依赖导致VTA和NAc病理学改变及与多巴胺调节蛋白、内质网应激蛋白的表达变化及相关关系未见报道。神经胶质细胞源性神经营养因子(Glial derived neurotrophic factor,GDNF)、同源盒蛋白转录因子1(Engrailed1,EN1)、α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)均是神经细胞发育、生存中重要的调控蛋白,因此本研究的目的之一是探明吗啡依赖对上述重要调节蛋白表达的影响。另外吗啡依赖对机体来说是一种应激刺激,以往研究提示内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关蛋白可能在依赖性药物导致的病理性改变中发挥作用,蛋白肌醇需酶1(Inositol-requiring enzyme 1,IRE1)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase,PERK)是内质网应激标志性蛋白,探明它们是否参与了慢性吗啡依赖导致的神经损伤是本研究的目的之二。鉴于以往对吗啡依赖的研究主要集中在代谢及机能方面,本研究采用病理形态学为主的研究手段观察了不同时程吗啡依赖VTA和NAc神经细胞的病理学改变,并进一步探讨了多巴胺调节蛋白、内质网应激相关蛋白的表达变化及与神经细胞损伤之间的相关关系,旨在为吗啡依赖导致神经损伤的机制研究提供病理形态学依据。方法:1. 随机分组各组大鼠,采用背部皮下递增注射盐酸吗啡的方法,建立吗啡依赖模型。给予盐酸纳洛酮诱导戒断症状后评分,确认吗啡依赖后建立不同时程吗依赖模型。2. 记录大鼠体重变化。3. 旷场实验观察大鼠行为变化。4. 焦油紫染色观察VTA病理形态学改变。5.HE染色观察NAc病理形态学改变。6.免疫组化双重标记NEUN和TH观察NAc神经细胞及多巴胺神经纤维表达变化。7.免疫荧光多重标记探讨VTA多巴胺调节蛋白EN1、GDNF及内质网应激蛋白IRE1、PERK的表达变化。8.免疫组织化学染色观察NAc多巴胺调节蛋白EN1、GDNF、α-Syn表达变化。结果:1.大鼠戒断症状结果皮下注射盐酸纳洛酮诱导大鼠戒断症状,结果显示与对照组相比,吗啡组出现明显戒断症状。依据戒断症状评分标准,吗啡组与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。表明吗啡依赖大鼠模型建立。2.大鼠体重变化结果随时间的延长,各组大鼠体重呈逐渐上升趋势,但与对照组相比,吗啡依赖组大鼠体重增长明显降低。3.旷场实验结果与对照组相比吗啡依赖组大鼠的移动总距离、中央区运动距离、中央区运动时间呈下降趋势,吗啡依赖组大鼠出现明显焦虑。4.VTA病理学改变随着吗啡依赖时间延长,出现组织水肿、细胞固缩、神经细胞尼氏体结构不清、消失现象,固缩、深染神经细胞数目增多。5. NAc病理学改变随着吗啡依赖时间延长,神经细胞出现水肿、噬神经现象、神经细胞结构不清,核膜消失,神经细胞数目减少。6. NAc TH与NEUN表达随着吗啡依赖时间的延长,NAc神经细胞数目减少,多巴胺能神经纤维减少明显。7. VTA多巴胺调节蛋白及内质网应激蛋白表达变化与对照组相比,吗啡依赖1周组TH~+-EN1~+阳性细胞百分比无明显差异。吗啡依赖3周、6周组TH~+-EN1~+阳性细胞百分比明显下降。与对照组相比,吗啡依赖1周、3周、6周组TH~+-GDNF~+阳性细胞百分比显著下降,与3周组相比,6周组TH~+-GDNF~+阳性细胞百分比上升。与对照组相比,吗啡依赖1周组TH~+-p-PERK~+阳性细胞百分比无明显差异。吗啡依赖3周、6周组TH~+-p-PERK~+阳性细胞百分比明显上升。与对照组相比,吗啡依赖1周组TH阳性细胞数目无明显差异,吗啡依赖3周、6周组TH阳性细胞数目明显减少;与对照组相比,吗啡依赖1周、3周p-IRE1阳性细胞数明显增多。8. NAc多巴胺调节蛋白表达变化情况与对照组相比,吗啡依赖1周组EN1阳性表达无明显差异,吗啡依赖3周、6周组EN1阳性表达明显降低。与对照组相比,吗啡依赖1周组α-Syn阳性表达无明显差异,吗啡依赖3周、6周组α-Syn阳性表达明显增高。与对照组相比,吗啡依赖1周、3周、6周组GDNF阳性表达逐渐下降,与3周组相比,6周组GDNF阳性表达上升。结论:本研究在建立不同时程吗啡依赖大鼠模型的基础上,采用常规HE染色、组织化学特染焦油紫染色、免疫组织化学染色、免疫荧光多重标记进行了实验研究,得出以下结论:慢性吗啡依赖可导致VTA及NAc神经细胞的病理性损伤;慢性吗啡依赖中多巴胺调节蛋白EN1、GDNF、α-Syn及内质网应激相关蛋白IRE1、PERK的表达呈现了明显动态变化,提示上述蛋白可能参与了与VTA及投射区NAc神经细胞的病理性损伤。