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研究目的通过建立小鼠胚胎干细胞体外胰岛素-转铁蛋白-硒-纤维连接蛋白(Insulin-Transferrin-Selenium-Fibronectin, ITSFn)神经分化培养模型,观察三种多溴联苯醚(Pentabromocyclododecenes, PBDEs)的神经发育毒性作用机制,并确定作用的关键环节,为进一步研究PBDEs的神经发育毒性探索新的思路和研究手段。研究方法1.建立五阶段的神经分化模型：阶段一,体外培养未分化的小鼠胚胎干细胞；阶段二,ESCs悬滴培养得到拟胚体,EB培养2天使其贴壁；阶段三,ITSFn筛选培养基筛选神经前体细胞(Neural precursor cells, NPC) (5-7d);阶段四,对NPC进行扩增和维持；阶段五,NPC分化为多巴胺能神经元和少量神经胶质细胞。2.利用Real Time-PCR检测神经特异性基因表达；利用免疫组织化学方法检测神经特异性蛋白表达；选用MPTP检测神经元的存在。3.采用Real Time-PCR检测PBDEs对相关分化基因表达的影响；利用ELISA及比色法检测细胞毒性、氧化应激的变化；通过流式细胞仪检测凋亡状况；利用免疫荧光法及Image Pro Plus 6.0分析突触延伸和突触联系的变化。4.受试物PBDEs及甲状腺素剂量设置以噻唑蓝法确定的半数抑制率(50% inhibitory concentration, IC50)为依据。结果1.随着神经分化的进行,在神经前体细胞和神经元成熟阶段(阶段模型四、五),分化获得的神经样细胞表达神经元特异性基因、蛋白,并具有分泌神经递质多巴胺的功能,并且细胞对于神经选择性毒物MPTP具有较强的敏感性。2. PBDEs在神经分化起始阶段对ES细胞Nanog、Sox2、Oct4基因表达有促进作用,在神经分化过程中对Basic helix-loop-helix, Netrin-1, Olig2, Nkx6.1基因表达有抑制作用；而加入甲状腺素,可有效的抑制PBDEs对神经发育中标记基因netrin-1和olig2的表达干扰。3. PBDEs显著增加神经分化的ES细胞的氧化负荷如GSH, SH, GSSG, ROS,显著降低抗氧化能力如SOD、GSH-PX和CAT活性,集中影响于神经前体细胞期到神经元成熟期；甲状腺素对于PBDEs的增加氧化负荷效应有抑制作用。PBDEs显著降低神经分化细胞的抗氧化能力如过氧化氢酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、过氧化氢酶(CAT),影响作用集中于神经分化的胚胎期、神经前体细胞及成熟神经元分化增殖期；甲状腺素只对PBDEs对GSH-PX的干扰有抑制作用。4. PBDEs在nesting田胞筛选阶段和神经前体细胞形成期,具有较强的细胞凋亡诱导作用；甲状腺素对于这种凋亡诱导没有抑制作用。5. PBDEs具有神经细胞毒性,显著降低细胞膜的钠钾ATP酶活力和钙镁ATP酶活力,影响集中于神经前体细胞形成阶段；甲状腺素对PBDEs干扰钙镁ATP酶的作用具有抑制作用。6. PBDEs会降低树突、轴突长度,影响集中于神经前体细胞及成熟神经元形成阶段；甲状腺素对此作用有抑制作用。7. PBDEs对神经分化获得神经元的突触前蛋白形成有影响,对突触后蛋白形成的影响较小,甲状腺素对此作用有抑制作用。结论1.小鼠干细胞ITSFn神经分化模型在基因表达、蛋白、功能方面均有效重现了神经发育过程,可以用于神经发育毒性研究。2.三种PBDEs均具有一定的神经发育毒性作用,且可通过影响分化基因表达,增加氧化负荷,降低抗氧化能力,影响细胞膜ATP酶活力,诱发早期凋亡,影响发育中神经突触的延伸等机制实现。3.PBDEs的神经发育毒性作用的关键阶段集中于神经前体细胞形成阶段和成熟神经元分化阶段。4.甲状腺素对于PBDEs的神经发育毒性的多个作用途径,都具有抑制作用。