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寡核苷酸在固体支持物如玻璃、硅片、尼龙或塑料表面的牢固、密集、有规律的离散固定是基因芯片制作的关键步骤,它直接影响DNA与基片的结合强度与效率,进而影响杂交结果。
目前用作DNA微阵列制作的基片材料多为玻璃片。我们通过研究玻璃片不同的处理方法对杂交产生的信号强度、形貌均一性,耐热性以及重复性的影响,从而对表面修饰中所涉及的方法进行了优化研究。由于玻璃具有不易加工成特殊形状的缺点,为探索适用于管盖基因芯片平台的新的易加工和更加实用的寡核苷酸固定基片材料,研究了有机高分子材料-聚碳酸酯基片的表面功能化改性和手臂系统的连接。
论文的主要研究内容如下：
一、对玻片进行表面化学处理。首先分别使用同源双功能偶联剂和非同源双功能偶联剂进行手臂连接以及在玻片表面连接上具有溶胀性的聚合物分子来克服上样量不足的缺点。本研究利用表面化学反应将富含氨基的化合物或聚合物以共价键方式连接到预先硅烷化的显微载玻片上。然后利用官能团交联分子活化玻片表面,使DNA能快速、稳定地结合在玻片上；为了确定玻片的性能,制备了几种不同的双组分官能团试剂表面化学处理的玻片。并对各种方法的结果进行了比较和分析。三类方法均得到较好的信号强度和较低背景,其中带有不同官能团的偶联分子 4-nitrophenyl-chloroformate修饰后的信号点均一性最好,当应用不同的点样缓冲液进行探针阵列的打印时,得到的信号点的大小和锐化程度不同,由NaHCO3 (PH=9.0)作为点样缓冲液时得到的点阵列的信号点偏大,更加圆润,并且同一性更好。PAMAM树枝状大分子的引入增加了表面上样量。
二、玻片表面修饰方法改进：采用的包被剂是丙烯酸-丙烯酰胺单体,活化剂是碳二亚胺和N-羟基琥珀亚胺酯官能团分子。将被修饰好的玻片用于芯片的制备,并进行杂交检测分析。与双功能偶联剂手臂系统比较,这种方法快速、简单,表面同定效率高、杂交后点的同一性好、荧光背景低、有着较好的热稳定性和化学稳定性,可重复利用。同时,它还具有制作过程接触物毒性小、成本低,能进行大规模的生产,是一种简便高效的芯片表面修饰方法。
三、管盖芯片平台中聚碳酸酯表面的修饰改性,H2和N2混合气体等离子体处理聚碳酸酯基片,采用X-射线光电子能谱证实在其表面接枝了大量活性氨基：以正交试验法优化聚碳酸酯等离子体处理条件。同时,在改性后的聚碳酸酯上衍生手臂系统：琼脂糖膜修饰,琼脂糖&聚丙烯酰胺混合胶修饰,丙烯酸一丙烯酰胺聚合物包被分别进行修饰。研究结果表明：丙烯酸一丙烯酰胺聚合物包被最为方便,快捷；琼脂糖膜修饰方法次之：琼脂糖&聚丙烯酰胺混合胶修饰最为繁琐。琼脂糖膜修饰的管盖表面耐热性较差,高温下会出现膜体剥落的情况,无法重复多次杂交利用。综合寡核苷酸探针的固定、反应性和背景强度等因素,制备管盖芯片用丙烯酸一丙烯酰胺聚合物包被效果最好,并且操作简单快速、制作成本低。本研究为管盖芯片的实际应用建立了高效稳定的平台。