论文部分内容阅读
果胶酶具有广阔的商业用途，在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。Aspergillus fungi是生产果胶酶最常用的菌种，一直用于传统发酵食品的生产，自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少，且活性较低。果胶酸裂解酶（pectate lyase）和果胶酸水解酶（polygalacturonase）在生物界中来源广泛，在植物，真菌和细菌中都有报道。从一系列不同的植物组织中，如萌发的种子，花粉，植物细胞发酵液，成熟的水果等，研究人员获得到多种Pectate lyase和polygalacturonase基因。Pectate lyase A（PelA）来自于Aspergillus nidulans，polygalacturonase A（PGA）来自于Aspergillus oryzae。本文成功地构建了Aspergillus nidulans PelA和Aspergillus oryzae PGA原核高效表达体系。通过RT-PCR扩增得到不含信号肽的PelA cDNA，它的序列被连接到pMD18-T Vector（TaKaRa），用DNA限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ将不含信号肽的PelA cDNA从pMD18-T-pelA切下，连到pET-28a（+）表达载体（Novagen）构建pET-28a（+）-pelA，转化E．coli Turner（DE3）placⅠ细胞（Novagen）。pET-28a（+）-pelA-Turner（DE3）placⅠ重组菌采用0.5mM IPTG诱导，20℃低温表达60h，0℃条件下超声破碎细胞后离心得到上清，上清用Ni-NTA His·BindResins（Novagen）进行一步纯化，在50 mM Tris-HCl，pH8.5的缓冲液中进行透析。重组酶活力可达360 UmL-1，是自然条件下产酶量的3600倍。Pel A仅对果胶酸和30％酯化度的果胶有裂解能力，对其它细胞壁多聚物没有作用。对果胶的裂解活性随甲基化程度上升和酸性化程度下降而变小，反之，随甲基化程度下降和酸性化程度上升而变强。PelA的最适酶反应条件pH 7.5-10，50℃。Mn2+，Ca2+，Fe2+，Mg2+和Fe3+对酶活力有不同程度的激活作用，而Cu2+和Zn2+对酶活力有部分抑制作用。用不同浓度的果胶酸作底物，检测该酶的酶动力学常数，Vmax为77μmol min-1mg-1，Km为0．50 mg mL-1。PelA对植物组织的尝试性研究发现该酶能有效解离绿豆等双子叶植物组织。同样通过RT-PCR扩增得到不含信号肽的PGA cDNA，它的序列被连接到pMD 18-T Vector（TaKaRa），用DNA限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ将不含信号肽的PGA cDNA从pMD18-T-pelA切下，连到pET-28a（+）表达载体（Novagen）构建pET-28a（+）-pgA，转化E．coli Turner（DE3）placⅠ细胞（Novagen）。转化子pET-28a（+）-pgA-Turner（DE3）placⅠ的构建首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达，进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃条件，220rpm，培养pET-28a（+）-pgA-Turner（DE3）placⅠ细胞，OD600至0.8左右时，用500μM isopropylβ-D-thiogalactogalactop-yranoside（IPTG）进行诱导表达，在15℃和170rpm条件下继续培养24h，表达效果最好，相对于每毫升培养基而言，产酶可达到70 UmL（-1），是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍，远优于文献报道的重组表达的PGA酶活。PGA对果胶底物的降解能力同Pel A。PGA的最适酶反应条件pH 5.0-5.5，50℃，Cu2+和Zn2+对酶活力有部分抑制作用。PGA对植物组织的尝试性研究发现该酶也能有效解离绿豆等双子叶植物组织。