论文部分内容阅读
目的:本研究在建立大鼠类风湿性关节炎模型基础上采用柱前衍生-HPLC-UV技术,通过定量分析大鼠在类风湿性关节炎形成前后血清样品及尿样中内源性小分子代谢物(即多种氨基酸)的变化以筛选出潜在的生物标志物,据刺山柑提取物干预前后潜在生物标志物的变化进行刺山柑抗类风湿性关节炎有效性评价和作用机制的探讨。方法:1)通过小鼠抗炎试验筛选出抗炎活性最强的刺山柑提取物。2)建立胶原诱导性的大鼠类风湿性关节炎模型并验证筛选出的刺山柑提取物的抗炎活性。3)建立测定大鼠血清中氨基酸与尿样中氨基酸的柱前衍生-HPLC-UV方法,对正常组、RA模型组、阳性对照药组及刺山柑水提物组大鼠的血清和尿样中氨基酸进行定量分析,采用多元统计、无监督分析方法的主成分分析方法(PCA)和有监督分析方法的偏最小二乘法-判别模式(PLS-DA)对测得结果进行分析,找出类风湿性关节炎的潜在生物标志物,对维药刺山柑抗类风湿性关节炎有效性进行评价并探讨其作用机制。结果:1)小鼠足趾肿胀法结果表明刺山柑水提物组的动物干预效果与空白对照组存在显著性差异(p<0.05),与阳性对照组无差异(p>0.05),抑制小鼠足肿胀的效果最明显;二甲苯所致小鼠耳片肿胀结果表明刺山柑水提物高剂量组的动物干预效果与空白对照组存在显著性差异(p<0.05),与阳性对照组无差异(p>0.05),抑制小鼠耳片肿胀的效果最明显;小鼠抗炎试验结果表明刺山柑水提部分的抗炎活性最强。2)成功建立大鼠类风湿性关节炎模型,水提物干预结果表明:与模型组相比,雷公藤组、水提高、中剂量组动物的足爪厚度肿胀度、足爪容积肿胀度有差异(P<0.05),提示水提物高中剂量组具有较为显著的抑制牛Ⅱ型胶原所致大鼠足跖肿胀的效果;水提物三个剂量组TNF-α、IL-1β水平与模型组相比具有显著性差异(P<0.01),与雷公藤组相比没有显著性差异(P>0.01),提示刺山柑水提物能下调牛Ⅱ型胶原所致大鼠关节炎模型血清中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平来发挥抗炎作用;免疫器官指数测定结果表明刺山柑水提物各组和雷公藤组可能通过增强机体的细胞免疫、促进免疫器官发育来发挥一定的免疫调节作用;水提物高剂量组、雷公藤组与空白组大鼠足部X光线检查结果近似,病理学检查结果表明刺山柑水提物高剂量组对牛Ⅱ型胶原所致大鼠关节炎模型具有较好的抗炎效果,其抗炎效果优于雷公藤组;通过各项检测指标表明刺山柑水提部分确有较好抗炎活性,因此将刺山柑水提部分作为代谢组学分析的给药部分。3)建立了符合方法学要求的用于测定类风湿性关节炎大鼠血清中16种氨基酸含量的柱前衍生-HPLC-UV分析方法。对大鼠血清样品中氨基酸浓度进行测定并进行多元统计与PCA分析、PLS-DA分析,结果表明丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、色氨酸这六种氨基酸在模型组中与空白组有显著性差异,RA大鼠给予刺山柑水提物后,氨基酸被回调至正常水平,提示这几种氨基酸可能为牛Ⅱ型胶原所致大鼠关节炎的生物标志物。PCA分析、PLS-DA分析结果表明,RA大鼠给予刺山柑水提物干预后,给药组的样本、阳性对照药组样本与模型组样本明显分开,而与正常组样本接近,说明刺山柑水提物对牛Ⅱ型胶原所致大鼠关节炎模型具有较好的抗炎作用。4)建立了符合方法学要求的用于测定类风湿性关节炎大鼠尿样中13种氨基酸含量的柱前衍生-HPLC-UV分析方法。对大鼠尿样样品中氨基酸浓度进行测定并进行多元统计、PCA分析与PLS-DA分析,对比分析模型组与空白组大鼠造模前、峰值与LAST点数据,甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、犬尿氨酸持续显示出差异性,提示可能为RA形成发展过程中潜在的生物标志物。RA大鼠给予刺山柑水提物后,氨基酸被回调至正常水平,说明刺山柑水提物对牛Ⅱ型胶原所致大鼠关节炎模型具有较好的抗炎作用,其中谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸与血清检测结果相吻合。结论:1)刺山柑提取物能使模型动物的代谢谱型向正常动物回归,代谢组学对维药刺山柑抗类风湿性关节炎有效性的评价与传统药效学研究结果一致。2)借助代谢组学方法可以检测机体内氨基酸代谢循环通路的状态,是评价RA大鼠体内代谢变化的有效手段,为探究类风湿性关节炎机制及在分子水平进行刺山柑水提部分综合药效评估奠定了基础。