论文部分内容阅读
诺西肽(Nosiheptide, Nos)又称那西肽,是由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)产生的一种含硫多肽类抗生素,与盐屋霉素、微球菌素、高硫青霉素、硫链丝菌肽及GE2270A等同属于硫肽类抗生素。它主要抑制革兰氏阳性菌的生长,最低抑制浓度仅为8ng/mL,对部分革兰氏阴性菌及少量病毒也有一定的抑制作用。由于诺西肽具有毒副作用低,抑菌活性高及无残留等优点,已被开发为一种新型饲料添加剂,广泛应用于促进禽畜的生长以及疾病的预防控制等领域,但产量较低一直限制其广泛应用的主要因素,本研究主要通过表达外源基因来提高诺西肽的产量,但是产量较低一直是限制其广泛应用的主要因素,本研究主要通过表达外源基因来提高诺西肽的产量。血红蛋白是一种能与O2进行可逆性地结合,广泛存在于动物、植物及微生物中的球蛋白。Vitreoscilla hemoglobin (VHb)是存在于透明颤菌属的血红蛋白,当O2浓度较低的情况下可以被大量诱导表达,以满足贫氧条件下对氧气的需求。随着基因工程的不断发展,发现表达VHb的vgb基因不仅能够在大肠杆菌中稳定存在和表达,而且还可以在真菌、假单胞菌、链霉菌等中成功表达,能显著提高α-淀粉酶、放线紫红素、红霉素等次生代谢产物的产量。bld基因家族是链霉菌中的全局性调控基因,目前已确定其成员包括bldA、 bldB、bldC、bldD、bldH及bldK等,其中bldD基因对形态分化及抗生素的形成的调控作用较为明显。在天蓝色链霉菌中敲除bldD基因后,突变体由于缺少气生菌丝表现出“光秃”表型,而且所产生的放线菌紫素、十一烷基灵菌红素、钙依赖的抗生素都受到了不同程度的抑制；在糖多孢红霉菌中敲除该基因后,红霉素的合成能力会大大下降,且在糖多孢红霉菌中过表达bldD基因可以明显提高红霉素的产量。本研究首先对S. actuosus的孢子种进行稀释涂板,挑取不同的克隆分别发酵,利用分光光度计法测定其诺西肽的产量,进而筛选出良好的出发菌株。然后利用PEG的介导作用将表达性载体pZM, pZM-vg6, pZMW和pZMW-vgb分别转化到S. actuosus的原生质体中,成功构建了S. actuosus/pZM, S. actuosus/pZM-vgb, S. actuosus/pZMW及S. actuosuslpZMW-vgb四种工程菌株。将S. actuosus出发菌株及相应工程菌株同时接到SFM大斜面上进行活化,然后转接到发酵培养基中进行发酵培养,通过对枯草芽孢杆菌的抑菌活性分析及分光光度计法对其诺西肽含量进行定量测定,发现在S.actuosus中整合型表达vgb基因可以使诺西肽的产量提高50%。本研究还首次将链霉菌中的全局性调控基因bldD成功地转化到S.actuosus中,构建S. actuosus/pZMW-bldD,利用同样的检测手段对S. actuosus出发菌株及S. actuosus/pZMW-bldD菌株中的诺西肽进行测定,发现bldD基因可以稳定地整合到S. actuosus中,并且发现过表达bldD基因可以将诺西肽的产量提高68%。本研究通过增加vgb基因及bldD基因拷贝数,将vgb基因及bldD基因分别转入到S. actuosus中来研究这两个基因对诺西肽产量的影响,并成功获得产诺西肽的高产菌株：S. actuosus/pZMW-vgb和S. actuosus/pZMW-bldD。本研究不仅为通过研究调控基因来提高诺西肽产量奠定了基础,而且也为过表达bldD基因来提高其他抗生素的产量开拓了思路。