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血小板在生理病理过程中发挥着非常重要的作用。血小板最主要的功能是参与凝血和止血。当体内血小板水平显著降低时,如急性放射病,会导致机体出血和感染;相反,当血小板水平过高或血小板过度活化时,则会引发血栓性疾病。血小板是由骨髓中的巨核细胞产生。血小板的生成经历了造血干细胞定向分化为巨核细胞、巨核祖细胞扩增、巨核细胞分化成熟、多倍体形成、向血管窦的迁移及与内皮细胞的粘附、向血管窦伸出血小板前体及血小板产生和释放等阶段。我们前期研究发现,巨核细胞生成血小板受到微环境中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平调控。值得关注的是,ROS也是电离辐射损伤的主要介导因子,电离辐射可以诱导ROS大量产生,通过与细胞生物大分子结合而氧化损伤细胞,从而导致细胞凋亡或坏死。电离辐射后外周血细胞的大幅度降低与骨髓内造血细胞大量凋亡坏死有关。血小板减少是骨髓放射损伤后的主要表现之一,也是导致机体出血、感染乃至死亡的重要原因。因此,阻断电离辐射诱导的巨核祖细胞凋亡可以预防或减轻电离辐射后血小板减少症的发生,防治出血及感染。Klotho是一种主要由肾小管上皮细胞合成分泌的抗衰老蛋白。作为一种激素样蛋白,Klotho能够通过血液循环到达全身组织脏器,从而发挥广泛抗衰老作用。Klotho抗衰老作用与其强大的抑制活性氧生成及清除活性氧能力有关。研究证实,Klotho可以有效预防氧化应激诱导的内皮细胞和肾细胞凋亡。由于正常情况下血小板的生成及放射损伤所致血小板减少都与氧化应激有关,所以,Klotho是否能够参与血小板的生成调控和防治放射损伤引起的血小板减少,值得深入研究。另一方面,ROS在血小板活化过程中也发挥着关键作用。除了外源性ROS,血小板内的ROS及其下游信号通路在血小板激活、血小板与血管壁的粘附、血小板的募集与聚集及血栓形成中发挥重要的作用。某些疾病情况下,血小板异常活化常常会增加血栓形成的风险,从而导致缺血性疾病如心肌梗死、脑卒中的发生。但是,目前预防血小板活化和血栓形成的有效措施有限。研究证实,Klotho水平和功能与血栓形成疾病的发病风险呈高度负相关,同时,以血液循环中Klotho水平严重降低为特征的疾病-慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)常常并发血小板功能改变,提示Klotho*本课题受国家自然科学基金(81270290;81500087;81573084)资助作为一种抗氧化剂也可能会影响血小板的活化过程。因此,为了探讨Klotho对血小板生成与功能的影响及其病理生理学意义,在本研究中,我们以人原代巨核细胞和人巨核祖细胞株M07e细胞为研究对象,利用细胞活性分析和流式细胞术实验,分析Klotho对巨核细胞生成血小板整个过程的影响;随后,观察Klotho对放射损伤所致血小板减少的防治作用及机制;最后,复制小鼠5/6肾大部切除CKD模型,采用Western blot、流式细胞术、细胞免疫荧光、激光共聚焦及体内/外血栓形成实验,观察Klotho对CKD情况下血小板异常活化的抑制作用及相关机制。主要研究结果和结论如下:1.体外研究证实,正常情况下Klotho对巨核祖细胞的增殖、巨核细胞的分化成熟及血小板的产生和释放没有显著的影响作用。2.亚致死剂量的电离辐射可以导致巨核祖细胞ROS过度生成、大量凋亡及血小板水平严重降低。辐照前给予Klotho预处理可以抑制电离辐射诱导的巨核祖细胞ROS生成及凋亡,并加速小鼠电离辐射后血小板水平的恢复,提示Klotho对电离辐射后血小板减少症有一定的预防和救治作用。3.在CKD小鼠模型中,随着尿毒症毒素硫酸吲哚酚(Indoxyl sulphate,IS)在体内的蓄积,Klotho水平显著下降,而血小板的活性则表现出异常增高。4.IS在体内和体外均可诱导血小板高度活化,Klotho则能显著抑制IS诱导的血小板活化;CKD小鼠体内Klotho水平的降低会进一步加重IS诱导的血小板异常活化及血栓形成。5.体外研究结果表明,IS通过诱导血小板内ROS大量生成并激活其下游p38MAPK信号通路来促进血小板活化及血栓形成;而Klotho可以显著抑制IS诱导的血小板内ROS过度生成及p38MAPK激活,提示Klotho抑制IS诱导的血小板异常活化和血栓形成与其所具有的突出抗氧化应激能力有关。6.采用apoE-/-小鼠建立高脂血症及CKD合并高脂血症动物模型发现,IS及CKD诱导的血小板过度活化可以加速动脉粥样硬化进展,而外源性Klotho处理可以抑制IS及CKD诱导的动脉粥样硬化形成加速。总之,通过本实验研究,我们首次明确了Klotho作为一种内源性抗氧化蛋白,一方面可以预防电离辐射诱导的巨核祖细胞凋亡及血小板水平降低,另一方面还可以抑制IS诱导的血小板过度活化,从而防止血栓及动脉粥样硬化形成,为临床血小板减少症及血栓相关疾病的预防和救治提供新思路、新方法。