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松毛虫Dendrolimus spp.属于鳞翅目Lepidoptera枯叶蛾科Lasiocampidae,它们分布广,发生面积大,危害严重,是松林的重大害虫。利用昆虫病原真菌对松毛虫进行生物防治是实现其可持续控制的主要途径,其中,白僵菌是应用最广泛的一类病原真菌。但是,由于白僵菌的萌发、生长和侵染常需要较高的温度和湿度,以往防治松毛虫的菌种来源和应用范围主要局限在我国南方省份,北方低温干旱的气候条件对白僵菌的应用造成困难。在白僵菌防治松毛虫上的另一个问题是一些重要的致病机理还不清楚,特别是白僵菌侵染过程中次生代谢毒素对昆虫的作用机制还缺乏研究。为了深入认识白僵菌的致病机理,开发适应性强的高效致病菌株用于北方地区松毛虫的生物防治,本文以我们2006年从河北承德油松林内采集的自然感染死亡的油松毛虫Dendrolimus tabulaeformis Tsai et Liu的虫尸上分离得到的布氏白僵菌Beauveria brongniartii(Sacc.) Petch2382菌株为试验材料,利用菌株对北方地区原寄生地的生态环境和宿主具有适应性和遗传保守性的特点,开展了系统研究。内容包括:2382菌株的生物学特性研究、菌株次生代谢产物的分离纯化和主要化学成分鉴定,以及菌株次生代谢毒素的粗提物和主要毒素成分对油松毛虫幼虫的毒性作用测定;菌株的孢子感染和次生代谢毒素作用对油松毛虫幼虫体内两种解毒酶活性的影响;菌株代谢毒素对油松毛虫幼虫血细胞凋亡的影响;菌株侵染对油松毛虫幼虫体内糖代谢的影响。本研究为揭示白僵菌感染对油松毛虫的致病机理提供了新证据。本研究主要内容包括： ⑴2382菌株的生物学特性。测定了不同温度和湿度对菌落生长、孢子产量和孢子萌发率的影响。结果显示,2382菌株在25±1℃下菌落生长速率为(0.82±0.03) cm/d,显著高于其他温度条件(P<0.05),说明25±1℃为该菌株的最适菌落生长温度;在15±1℃、20±1℃、25±1℃三个温度条件下,产孢量分别是(4.89±0.19)×108孢子/cm2、(4.30±0.16)×108孢子/cm2、(3.72±0.56)×108孢子/cm2,显著高于30±1℃时的产孢量(3.18±0.21)×108孢子/cm2(P<0.05),说明该菌株的适合产孢温度范围在15±1℃-25±1℃;在25±1℃时,相对湿度分别为30±10％、50±10%、70±10%时,孢子萌发率分别为(8.03±0.25)%,(51.63±1.12)%,(93.10±2.25)%,说明相对湿度对该菌株孢子萌发影响较大。由以上结果表明2382菌株对温湿度有较宽的适应范围,有利于在林间温湿度变化较大的北方松林环境中存活和侵染,是在北方地区开展油松毛虫防治应用的一个潜在优良菌种。 ⑵2382菌株次生代谢产物的分离纯化、主要化学成分鉴定及其对油松毛虫的毒性作用。采用液体培养,得到2382菌株的发酵液,对发酵液进行离心、浓缩、醇沉和萃取,得到该菌株次生代谢产物粗提物为深红色粉末。用该粗提物对油松毛虫4龄幼虫进行染毒试验,其结果证明粗提物具有杀虫活性,半致死浓度为2.8×102μg/mL;采用硅胶柱层析对毒素粗提物进行分离得到6组物质,其中第6组物质的含量最大。用第6组物质(55μg/mL)对油松毛虫4龄幼虫作染毒试验,油松毛虫的校正死亡率为(60.15±3.41)%;利用GC/MS联用技术,对第6组物质进行化学成分分析,显示其包括17个组分,其中相对含量大于10%的有3种,即2-哌啶酮(占14.02%)、2-香豆满酮(占47.10%)、六氢化-吡咯环[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(占21.05%);用2-哌啶酮和2-香豆满酮(浓度为55μg/mL)分别对油松毛虫5龄幼虫作杀虫试验,校正死亡率分别为(67.83±1.52)%和(82.61±2.65)%。由此可知,2-哌啶酮和2-香豆满酮是该菌株的主要代谢毒素物质。该研究为白僵菌对油松毛虫致病机理方面的研究提供了新的理论依据。 ⑶2382菌株及其代谢毒素对油松毛虫体内两种解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(GST)和酯酶(EST)活性的影响。用菌株孢子悬液(浓度为6×105、6×106、6×107孢子/L)和菌株次生代谢毒素(浓度为5.5、55、550μg/mL)处理油松毛虫幼虫,测定虫体内GST和EST活性的变化。结果显示：用菌株孢子悬液和次生代谢毒素处理后,都能引起油松毛虫体内GST和EST活性升高。其中用孢子悬液处理后,虫体内GST活性在第3 d达到最大值,在浓度为6×106孢子/mL和6×107孢子/mL两个处理组的酶活性分别为0.050±0.010(μmol/min/mg protein)、0.184±0.013(μmol/min/mg protein),显著高于对照组的酶活0.032±0.004(μmol/min/mg protein)。以α-naphthyl acetate为底物时,虫体内EST活性在处理后的第3 d达到最大值,分别为0.159±0.003(μmol/min/mg protein)、0.184±0.005(μmol/min/mg protein)、0.237±0.009(μmol/min/mg protein),且3个浓度之间酶活的差异达到显著水平。以β-naphthyl acetate为底物时,虫体内EST活性出现了与以α-naphthyl acetate为底物时相似的变化趋势,在处理后的第3 d达到最大值,分别为0.214±0.006(μmol/min/mg protein)、0.227±0.001(μmol/min/mg protein)、0.266±0.005(μmol/min/mg protein)；用3个浓度的菌株次生代谢毒素处理后,虫体内GST活性在6 h达到最大值,分别为0.497±0.012(μmol/min/mg protein)、0.652±0.014(μmol/min/mg protein)、0.944±0.030(μmol/min/mg protein),且各时间点(2、4、6、12、24、48 h)之间和各浓度之间酶活的差异达到显著水平。以α-naphthyl acetate为底物时,虫体内EST活性在处理后的24 h达到最大值,分别为54.31±3.20(μmol/min/mg protein)、90.42±4.33(μmol/min/mg protein)、106.98±5.32(μmol/min/mg protein),且3个浓度之间酶活差异达到显著水平。以β-naphthyl acetate为底物时,虫体内EST活性出现了与以α-naphthyl acetate为底物时相似的变化趋势,在处理后的24 h达到最大值,分别为11.96±0.42(μmol/min/mg protein)、12.05±0.47(μmol/min/mg protein)、16.98±0.74(μmol/min/mg protein)。该研究结果表明,白僵菌2382菌株的孢子悬液和次生代谢毒素对油松毛虫都具有毒性作用,在白僵菌感染油松毛虫过程中,虫体内GST和EST是白僵菌的攻击靶标,菌株及其次生代谢毒素打破了油松毛虫体内解毒酶的免疫机制,导致寄主死亡。该研究首次为白僵菌次生代谢毒素作用于油松毛虫免疫系统的两种解毒酶提供了新的依据。 ⑷2382菌株次生代谢毒素对油松毛虫幼虫血细胞凋亡的影响。用2382菌株的次生代谢毒素(浓度5.5、55、550μg/mL)对油松毛虫4龄幼虫染毒处理,用荧光显微镜、透射电镜、流式细胞仪对幼虫血细胞的凋亡症状和凋亡率进行观察和检测。荧光显微镜观察结果显示,在染毒处理后的6 h,大部分血细胞处于早期凋亡阶段,发出均匀的黄绿色荧光。在处理后的12 h,血细胞大部分处于晚期凋亡阶段,发出不均匀的桔红色荧光。在对照组,幼虫的血细胞大部分为正常细胞,发出均匀的绿色荧光；用透射显微镜观察幼虫血细胞超微结构,结果显示,在处理组中,幼虫血细胞凋亡的病理学症状表现为细胞核皱缩,核膜有轻微褶皱,染色质发生凝集,线粒体内的嵴排列紊乱或消失,细胞质中产生气泡和纤维化凝集；用流式细胞仪检测幼虫血细胞凋亡率,结果显示,在处理后的6 h,用3个浓度的次生代谢物处理组,幼虫血细胞早期凋亡率分别为11.93%、13.10%、18.42%。血细胞晚期凋亡出现在处理后的12 h、24 h、36 h。其中在用浓度为55μg/mL的处理组,处理24 h后出现了最大凋亡率为(36.54±4.37)%。血细胞凋亡率与次生代谢毒素的浓度与作用时间具有相关性。用三种不同的技术手段和方法,揭示了2382菌株次生代谢毒素能够攻击油松毛虫幼虫血细胞并诱导其凋亡。为病原真菌在感染宿主昆虫过程中,能以次生代谢毒素作用于宿主的血细胞免疫功能,提供了新的证据。 ⑸2382菌株侵染油松毛虫幼虫后虫体内糖代谢的变化。为了揭示病原真菌白僵菌侵染昆虫过程中如何转化和利用虫体内糖类物质作为自身营养,本研究测定了2382菌株感染油松毛虫幼虫后,虫体血淋巴中酸性海藻糖降解酶活性及海藻糖和葡萄糖含量的变化。结果显示,油松毛虫4龄幼虫感染菌株孢子悬浮液后,血淋巴中酸性海藻糖降解酶的活性明显高于对照组,感染后第3d酶活性达到最大值为(0.2786±0.0446) U/mg,此后第4-6 d酶活性逐渐降低;染菌后的6d中,血淋巴中海藻糖含量显著低于对照组,同样在感染后第4d其含量逐渐降低,第6d时降到最低值。相比之下,处理组血淋巴中的葡萄糖含量显著高于对照组,其含量在第1-3 d内呈现快速升高趋势,在第3 d达到最大值为(7.7615±0.4040) mmol/L,然后逐渐降低。由此说明,2382菌株侵入油松毛虫血淋巴后,菌株代谢产生酸性海藻糖降解酶,将血淋巴中的海藻糖水解成为葡萄糖,然后为真菌利用,破坏了虫体内的血糖平衡,这是一个相互连接的生理代谢和生化反应过程。该研究为白僵菌感染油松毛虫过程中虫体内糖类转化提供了新的证据。 ⑹研究液体培养条件对该菌株代谢产物产量的影响。采用正交试验(4因子3水平)的方法,研究了培养条件对该菌株液体扩大培养产生代谢产物的影响。结果显示,4个试验因子中对代谢毒素产量影响的强弱顺序依次为培养基初始pH值(B)>培养时间(A)>培养温度(D)>转速(C)。在4因子3水平的试验中,菌株产生代谢毒素的最佳培养条件为:培养10 d、培养基初始pH值5.0、转速140 r/min、30℃(A2B1C2D3)。此研究对大量提取白僵菌代谢产物具有重要的意义。