论文部分内容阅读
第一部分利用聚吡咯生物素混合纳米芯片对孕妇外周血中胎儿有核红细胞的捕获和“双阳性”荧光鉴定目的:利用纳米材料芯片分离捕获及鉴定孕妇外周血中的胎儿有核红细胞,确定胎儿有核红细胞捕获的最佳孕周,并了解胎儿染色体非整倍体异常的妊娠和胎儿有核红细胞数目之间的关系。方法:取孕10-30周的无基础疾病及妊娠合并症的正常妊娠孕妇外周血48例和无基础疾病及妊娠合并症的胎儿异常妊娠孕妇外周血12例,经Ficoll密度梯度离心后,获得单核细胞层,之后经过CD147修饰的聚吡咯生物素混合纳米材料芯片捕获,获得的细胞通过CD71+/ε-HBF+/DAPI免疫荧光(immunofluorescence,IF)及荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)的双重荧光鉴定,确定为胎儿有核红细胞。结果:CD147对于胎儿有核红细胞具有显著的抗原特异性。IF联合FISH技术的“双阳性”荧光鉴定能够确定捕获细胞为胎儿有核红细胞。男胎检测准确率达100%。孕妇外周血中胎儿有核红细胞的数目在中孕期较早、晚孕期数目多,其中孕18周时数目最多。在胎儿染色体非整倍体异常妊娠中,母体外周血中胎儿有核红细胞数目显著高于同孕期的正常妊娠组(P<0.01)。结论:抗体CD147修饰的聚吡咯生物素混合纳米材料芯片以其制作简便、操作简单及使用经济的特点,可以作为捕获孕妇外周血中胎儿有核红细胞的最佳方法之一。孕18周胎儿有核红细胞数目最多,胎儿染色体非整倍体异常的妊娠孕妇外周血中胎儿有核红细胞数目较正常妊娠增多,此种现象可为无创产前诊断判断胎儿异常提供新思路。第二部分 聚吡咯生物素混合纳米芯片对捕获后的胎儿有核红细胞的原位释放及胎源性鉴定目的:探索将聚吡咯生物素混合纳米芯片捕获的胎儿有核红细胞进行原位释放,并将其用于产前诊断的可行性。方法:在不同的电压及作用时间下,以TF-1细胞系为模型,对聚吡咯生物素混合纳米材料芯片捕获的有核红细胞进行释放,测定释放效率及细胞损失效率,获得最佳释放电压及作用时间。并用26例产妇脐带血作为样本,用PCR技术检测释放回收细胞的AMXY基因和X-STRs位点。结果:0.3V、0.5V和0.8V对纳米芯片上捕获的有核红细胞的释放率分别为68.3%,76.2%和94.6%,0.8V电压分别作用5s、15s和20s,对纳米芯片上捕获的有核红细胞的释放率分别为54.7%,70.3%和91.2%。26例脐血中胎儿有核红细胞经芯片捕获后,再经过0.8V电压作用15s,AMXY联合X-STRs位点(DXS10103和DXS10101)对胎儿性别检测效能为92.3%,高于单独AMXY基因检测效能80.8%和X-STRs位点检测效能73.1%(DXS10103)和 80.8%(DXS10101)。结论:聚吡咯生物素混合纳米芯片可以对捕获的有核红细胞成功进行电释放。在0.8V电压作用15s对聚吡咯生物素混合纳米芯片上捕获的有核红细胞的释放效率最高,细胞损失率最小。AMXY联合X--STRs位点的PCR检测确定了释放细胞的胎儿源性,进一步表明释放的细胞可以用于后续的检测。第三部分利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行无创性产前诊断实验一孕妇外周血中胎儿有核红细胞的荧光原位杂交诊断胎儿染色体非整倍体异常目的:探索利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行胎儿染色体非整倍体异常的可行性。方法:孕中期基于孕妇外周血中胎儿游离DNA的无创产前筛查或(和)影像学检查检测出的可疑染色体异常病例18例,以纳米芯片捕获胎儿有核红细胞,采用GLP21/13,CSP18/X/Y探针对捕获的胎儿有核红细胞进行荧光原位杂交分析,之后和孕妇的羊水核型分析结果进行对比。结果:早、中孕产前筛查异常病例18例中有13例经羊水核型分析诊断为染色体非整倍体异常,纳米芯片捕获胎儿有核红细胞FISH检测出胎儿非整倍体异常有12例,其中21三体5例、13三体3例、18三体2例和Klinefelter’s综合征2例,除一例Klinefelter’s综合征未检测出来,其余结果均吻合,FISH和核型分析结果符合率为92.3%。结论:利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞可以成功诊断非整倍体异常。实验二孕妇外周血中胎儿有核红细胞的全外显子测序诊断胎儿微缺失综合征目的:探索利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行胎儿微缺失综合征的可行性。方法:孕中期通过羊水穿刺和染色体微阵列分析(CMA)检测出一例胎儿18q21微缺失综合征,以聚吡咯生物素混合纳米芯片捕获孕妇外周血中胎儿有核红细胞,对其进行全外显子测序,和孕妇口腔黏膜脱落细胞全外显子测序结果进行比对。结果:孕期捕获的胎儿有核红细胞全外显子检测和孕妇口腔黏膜脱落细胞全外显子检测结果比对后检测出18号染色体上30个基因的重复,35个基因的缺失,其中包括CMA检测出来的致病基因DYM,和羊水穿刺染色体微阵列分析结果一致。结论:全外显子测序技术在孕妇外周血中胎儿有核红细胞中的应用,为无创产前诊断进行胎儿微缺失/微重复综合征的诊断提供了有效的技术支持。