论文部分内容阅读
高果糖浆（HFCS）是一种可替代蔗糖的甜味剂,工业上通过葡萄糖异构酶异构葡萄糖生成果糖而得到的这两者的混合物—HFCS。目前国内生产高果糖浆的企业,仍然依赖国外商业化生产的葡萄糖异构酶,而且商业化的葡萄糖异构酶只能在60 oC左右催化得到42-45%果糖含量的HFCS,为了获取市场需求量较大的55%HFCS还需要进行色谱分离,提高了生产成本。本论文是以重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）/pET28b-TEGI为出发菌株,旨在构建转化率大于55%的葡萄糖异构酶重组菌。首先从PDB数据库中搜索与目标葡萄糖异构酶同源性最高的蛋白质晶体结构,以其为模板进行同源建模,并且以底物D-葡萄糖为配体,将两者在分子对接软件Autodock中进行分子对接,再从对接结果中,在提高酶活的基础上理性分析,从而选择可行的突变点,采用点饱和突变和定点突变技术进行改造。最终得到具有更优操作性的突变菌株E.coli BL21（DE3）/pET28b-TEGI-W139F/V186T。随后,由于获得的葡萄糖异构酶突变体带有6个His标签,因此,我们采用Ni-NTA柱亲和层析的方法进行纯化以获得纯酶,研究其酶学性质,包括最适温度、热稳定性、最适p H、pH稳定性、反应动力学参数、金属离子对其酶活的影响等催化特性。最终结果表明此酶的最适温度为90 oC,并且在此温度下保温了24 h的酶的残余酶活为初始酶活的68.4%,是原始TEGI的1.2倍;最适pH为6.5,在此pH下保存了24 h后的酶的残余酶活为初始酶活的82.4%,稳定性略微好于原始TEGI;Co2+对野生型TEGI和突变体TEGI-W139F/V186T的催化活力都起着非常重要的作用,经过突变后的葡萄糖异构酶突变体TEGI-W139F/V186T对离子的耐受性有所改变,对Ca2+的耐受性提高很大,其中Mg2+、Mn2+、Ba2+在酶催化当中起到辅助作用。经突变改造后的葡萄糖异构酶TEGI-W139F/V186T的Km值低于野生型TEGI的Km值,kcat/Km值是野生型的1.9倍,因而突变体对底物葡萄糖的亲和力、催化效率高于野生型葡萄糖异构酶。从温度,pH,金属离子浓度,菌体浓度以及底物浓度等方面对葡萄糖异构酶突变体静息细胞催化D-葡萄糖生成HFCS的反应条件进行优化。最终确定了最佳反应体系:50 mM PBS,pH 6.5,最适反应温度为90 oC,Mg2+添加浓度15 mM,Co2+添加浓度2 mM。在优化条件下,3%（w/v）突变体TEGI-W139F/V186T静息细胞催化200 mg/mL底物D-葡萄糖1.5 h后,反应达到平衡,果糖得率维持在53%以上,最高达到55.4%。为一步法生产55%HFCS奠定了一定的基础。