论文部分内容阅读
杀虫真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和布氏白僵菌（B.brongniarti）能够产生一种红色、醌类次级代谢产物卵孢霉素(oosporein)，呈弱酸性，具有良好的抗真菌、细菌及杀虫活性。作为真菌毒素，卵孢霉素还可导致家禽痛风病。正是因为卵孢霉素的重要作用和影响，几十年来人们一直在试图解析其生物合成途径，为该化合物的利用或毒素预防服务，但由于前期基因组信息的缺失及真菌遗传转化存在技术问题等，这一问题一直没有解决。 本实验室在联合完成球孢白僵菌基因组研究的基础上，通过生物信息学分析，在白僵菌基因组中发现了42个可能参与白僵菌次级代谢的基因簇。其中有12个基因簇参与聚酮类(PKs)化合物的合成。基于前期研究推测苷色酸(orsellinicacid)可能是卵孢霉素合成的前体以及苷色酸由聚酮合成酶(PKS)参与合成，通过生物信息分析，两个编码PKS的基因BBA_06613和BBA_08179在白僵菌中被找到。通过对这两个基因进行敲除，基因BBA_08179最终被确定参与卵孢霉素的合成，其所在基因簇包含有7个基因，包括:聚酮合酶(PKS)OpS1（BBA_08179）、转运蛋白OpS2（BBA_08180）、转录因子OpS3（BBA_08181）、羟化酶OpS4（BBA_08182）、漆酶OpS5（BBA_08183）、谷胱甘肽转移酶OpS6（BBA_08184）和双加氧酶OpS7（BBA_08185）。为了验证这些基因的功能及其在卵孢霉素生物合成中的作用与功能，分别对这些基因进行了敲除，并将基因OpS1、OpS4、OpS5及OpS7在毕赤酵母中进行了异源表达。同时通过对中间产物的分离纯化和结构鉴定，并结合底物饲喂实验，最终确定了卵孢霉素的生物合成途径。同时将转录因子OpS3过表达，使得突变体卵孢霉素产量比野生型提高了3倍之多。 此外，本论文还对卵孢霉素的生物活性及其作用机理进行了研究。通过以大蜡螟幼虫为实验对象进行生物测定，研究发现卵孢霉素合成的缺失显著地降低了白僵菌的杀虫毒力。通过Western-blot和血淋巴黑化反应检测，发现卵孢霉素通过抑制多酚氧化酶的活性剪切来抑制多酚氧化酶(PPO)的活性。同时通过RT-PCR对大蜡螟脂肪体中抗真菌肽gallerimycin的转录水平进行检测，发现卵孢霉素可以抑制大蜡螟脂肪体中gallerimycin的转录。生测实验表明，卵孢霉素通过抑制昆虫的免疫系统而促进真菌的侵染过程。 总之，通过本论文的研究工作，发现了合成卵孢霉素的基因簇，并通过基因敲除、酵母异源表达、底物饲喂实验等研究揭示了基因簇中各基因的功能，完整解析了卵孢霉素的生物合成机理。此外，还通过过表达转录因子OpS3得到了卵孢霉素的高产菌株。生物学功能研究证明，卵孢霉素能够抑制昆虫免疫而促进白僵菌的感染。本论文的研究成果为卵孢霉素的开发利用和大规模生产奠定了基础。