【摘 要】
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为了研究AMPK信号通路对蛋鸡原代肝细胞脂肪变性的调控作用,本研究选取34-40周龄的海兰褐蛋鸡,通过原位二步灌流法建立蛋鸡肝细胞体外培养模型,利用1m M的油酸/棕榈酸(2:1)高脂培养液处理肝细胞构建脂肪变性模型。试验分为两组,分别为CK组(0m M油酸/棕榈酸)和FFA组(1m M油酸/棕榈酸),造模24h。随后检测蛋鸡原代肝细胞ICelligence系统下的细胞增殖活性;利用油红O染色观察
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为了研究AMPK信号通路对蛋鸡原代肝细胞脂肪变性的调控作用,本研究选取34-40周龄的海兰褐蛋鸡,通过原位二步灌流法建立蛋鸡肝细胞体外培养模型,利用1m M的油酸/棕榈酸(2:1)高脂培养液处理肝细胞构建脂肪变性模型。试验分为两组,分别为CK组(0m M油酸/棕榈酸)和FFA组(1m M油酸/棕榈酸),造模24h。随后检测蛋鸡原代肝细胞ICelligence系统下的细胞增殖活性;利用油红O染色观察脂质蓄积情况、糖原染色观察糖原含量变化;通过生化检测试剂盒测定细胞中脂质相关指标(TC、TG)、上清液葡萄糖含量(GLU)、氧化还原相关指标(SOD、T-AOC、MDA);通过吖啶橙/溴化乙锭染色,观察细胞凋亡情况;通过流式细胞仪测定细胞活性氧水平、细胞线粒体膜电位变化;基于PCR array技术测定AMPK信号通路中84个基因的m RNA表达量;此外,针对关键基因和蛋白(P-AMPK、ACC、P-ACC、AKT、Caspase-3、INSR)进行验证实验。结果如下:1.与CK组比较,FFA组发现大量脂质蓄积、糖原含量明显减少;ICelligence系统测定结果显示FFA组细胞增殖能力较CK组有所降低,但两组细胞活性没有显著差异(P>0.05)。2.与CK组比较,FFA组细胞中TG、TC、MDA含量显著或极显著上升(P<0.05或P<0.01),SOD和T-AOC的含量极显著下降(P<0.01),细胞上清液中GLU含量极显著下降(P<0.01)。3.与CK组比较,FFA组细胞凋亡率、细胞活性氧极显著上升;线粒体膜电位水平极显著下降(P<0.01)。4.与CK组比较,FFA组AMPK信号通路中的FASN、ACACB、ADRA2A、ADRA2C、HMGCS1、PFKFB3、PFKFB4、m TOR、TXNIP、FOXO3、TSC1、TSC2和TP53的m RNA的表达量显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01),CRTC1、CPT2、CPT1A、INSR、AKT1、PPARGC1B和CAMKK2的m RNA的表达量显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01)。5.与CK组比较,FFA组细胞的P-AMPK、P-ACC蛋白表达极显著下(P<0.01);ACC、Caspase 3蛋白表达显著上升(P<0.05);AKT、INSR蛋白表达呈下降趋势(P>0.05)。结论:蛋鸡原代肝细胞在脂肪变性的影响下,AMPK信号通路中FASN、ACACB、ADRA2A等基因量显著上调,CRTC1、CPT2、CPT1A等基因表达量显著下调,造成脂质、碳水化合物代谢紊乱,形成氧化损伤和细胞周期的改变。
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