论文部分内容阅读
器官和组织的形成是发育生物学中没有解决的神秘的问题。一个器官的形成已经证实很难去解剖,部分是因为这个过程非常连续而且复杂,同时也是因为大部分器官是在胚胎期发育,而这些过程是相互联系的,所有的这些使得研究一个特异的过程非常难。器官再生在成年动物当中也可能发生,尽管范围非常有限,包括丢失的器官的再生。一旦此过程发生,这个过程就可能从空间上分离开来,并且这个暂时的发育事件就可以作为器官生成的一个系统模式来研究。成年动物的器官再生的一个最显著的事件就是海参纲成员在吐脏后能够再生出多种器官。刺参能够在吐脏后迅速再生出其身体器官。新的消化道的发育是一个复杂的过程,包括基因表达的改变,从而导致了有关再生的细胞结构,免疫防御,细胞信号转导等方面的改变。我们将刺参作为一个模型系统利用组织学及现代分子生物学技术来研究刺参的再生。本研究以中国山东地区的养殖刺参(Apostichopus japonicus)为研究材料,刺参体长10~15cm,通过注射KCl(0.35mol/L)诱导吐脏。采用组织学方法对刺参吐脏和再生进行了观察,结果显示刺参吐脏后便开始再生,吐脏后的第2天可观察到呼吸树主干及分支结构。腹部肠系膜在吐脏后逐渐增厚,第5天可观察到肠上皮与肌肉组织,再生出新生肠管的时间大约为2周。表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)技术是近年兴起的一种高通量基因筛选和鉴别的有效方法。本研究利用EST技术对刺参的再生肠组织和正常肠组织表达序列进行大规模测序分析,旨在从EST数据中寻找与刺参再生相关的基因,同时也为今后刺参再生功能相关基因的筛选与克隆奠定良好基础。本文用表达序列标签方法,对刺参肠再生过程中的表达基因进行了鉴定。为了研究刺参再生肠组织与正常肠组织当中的差异表达基因,通过定向克隆法,构建了刺参正常肠组织的cDNA文库(NE)和吐脏后第3-5天再生肠组织的cDNA文库(PE);从每一个文库中取400个阳性克隆从5′末端进行测序,并对EST序列进行分析。首先,从刺参的再生肠组织和正常肠组织提取mRNA,然后反转录成cDNA,将反转录成的双链cDNA与载体连接构建质粒cDNA文库。结果显示从再生肠组织的cDNA文库当中获得了1.5×106个独立的阳性克隆,而从刺参