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【目的】 本研究将高表达于HCC的肿瘤相关抗原AFP作为基因免疫治疗的靶分子，利用人和小鼠AFP的高度同源性，以人AFP基因为目的基因构建AFP DNA疫苗，试图通过免疫机体，诱导其产生强烈的CTL杀伤活性达到抗肿瘤的目的。本课题还观察了在注射DNA疫苗后的不同时间段内肌肉注射部位细胞的聚集情况，并对细胞的性质进行鉴定，以揭示参与DNA免疫的细胞尤其是参与抗原提呈的细胞的实质，为进一步阐述DNA免疫的机制提供组织学证据；同时，对成肌细胞的生物学特性及MHC分子的表达进行研究，探讨其作为抗原提呈细胞的可能性。 【方法】 1．本研究从人胎肝组织中提取AFP基因，以全长基因序列为目的基因片段，构建AFP重组质粒phAFP，再经酶切分析和DNA测序对phAFP进行鉴定。将重组质粒phAFP经脂质体转染真核细胞CHO以及直接注射小鼠胫前肌，并采用SDS-PAGE、荧光免疫染色及免疫组化对其表达产物进行检测。 2．将构建的AFP DNA疫苗直接注射小鼠，从保护性和治疗性作用两方面，探讨该疫苗的抗肿瘤作用。 (1)AFP DNA疫苗保护性作用研究：首先将小鼠分为实验组：phAFP与phGM-CSF共注射、phAFP单独注射；对照组：phGM-CSF、空质粒pcDNA3.1(+)、空白对照(注射0.01mM PBS)，并按照此方案分别进行免疫注射。在注射后的第2、4周各加强一次。在初次免疫后的第3周对所有小鼠进行荷瘤，观察肿瘤的生长情况，每周用游标卡尺测量肿瘤大小1次。邓小玲博士学位论文舒P DNA疫苗治疗肝癌的实验研究分别在免疫接种的第3、6周眼眶取血，在免疫的第6周处死小鼠，取小鼠脾脏制成单细胞悬液，3H一TdR检测淋巴细胞、’‘C:释放法检测特异性CTL杀伤活性和NK细胞活性，ELISA法检测血清IFNY、TNFa。 (2)AFP DNA疫苗对HZ:荷瘤小鼠的治疗性作用 首先对所有小鼠进行荷瘤。荷瘤一周后免疫接种，实验份组、免疫注射及加强注射、剂量及检测指标、方法等，与保护性研究一致。 3.肌肉组织HE染色观察细胞聚集情况 在DNA注射小鼠后，分别于6h、12h、1d一6d切取注射部位肌肉组织，HE染色观察细胞聚集情况;LSAB法检测聚集细胞CD205、CD4及CDS分子的表达 4.成肌细胞的原代培养及荧光免疫染色检测成肌细胞的MHCI、MHCll分子表达，再将成肌细胞与不同浓度的IFNY一同培养，流式细胞术检测IFN丫对成肌细胞MHCI、MHCll分子的诱导表达。 【结果】 1.构建的AFP重组质粒与GenBank报道序列一致，确认所克隆的cDNA片段为人AFP的全长编码序列。结果还显示，phAFP能在体外真核细胞CHO、体内肌细胞中有效表达。 2.疫苗保护性作用研究显示，在pMFP与phGM一CsF共注射组、phAFP单独注射组小鼠中均能观察到T细胞有一定程度的活化，T淋巴细胞功能及CTL特异性反应增强，IFNY、TNFQ水平升高，并能部分抑制肿瘤组织的生长。phAFP与phGM一CSF共注射组CTL活性强于phAFP组，但两组之间比较无统计学差异。对疫苗治疗性作用研究发现，疫苗免疫的小鼠均产生了AFP特异的免疫反应，其中phAFP与phGM一CSF共注射组产生较强的CTL反应，IFNY、TNF。水平升高。p从FP单独注射组也获得了一定程度的抗肿瘤效应，但其IFNY、TNFa水平与各对照组相比无统计学差异。邓小玲博士学位论文灯P DNA疫苗治疗肝癌的实验研究 3.从疫苗注射的6h一6d，在肌肉组织间隙中发现有不同程度的细胞浸润，在6h一Zd之间，浸润细胞数量不多，从注射后的第3d开始，浸润细胞数量逐渐增多，第5、6d肌肉组织间隙中可见大量的浸润细胞。早期主要以巨噬细胞和淋巴细胞为主，晚期巨噬细胞样细胞占优势。 在疫苗注射后的6h~12h，未发现CDZOS+的细胞，在24h的肌肉组织中有少量的CD205阳性细胞，第3d时数量稍多，第4d一6d后Cn205染色均为阴性。对浸润的淋巴细胞的亚型进行鉴定发现，在6h~6d的肌肉切片中只检测到CD4+T细胞，未发现CDS+T细胞的细胞， 4.本研究采用反复差速贴壁法纯化成肌细胞，其纯度达95%以上，可满足实验要求。研究结果显示小鼠的成肌细胞培养发育时期与人成肌细胞有明显不同;未经任何处理的成肌细胞表达MHC一I类分子，未能检测到MHC一n类分子;当不同浓度的IFNY作用于成肌细胞后，成肌细胞呈现出不同程度的MHC一11类分子的表达，并与IFNY有剂量依赖趋势。 【结论】 采用不同种属之间同源性较高的AFP基因构建的DNA疫苗，能调动机体T细胞库中具有低或中等亲和力受体的T细胞克隆，并诱发其发挥抗肿瘤治疗效应，显示出较强的抗肿瘤作用。经DNA疫苗免疫注射的局部肌肉组织引发的细胞聚集于一般的炎症反应不同;浸润的DCS为处于幼稚状态DCS;DCS、CD4+T细胞参与DNA免疫并可能起着重要的作用。成肌细胞MHCI、MHCll分子的表达及诱导表达，提示成肌细胞具备抗原提呈的能力，在适当的环境条件下，可以作为兼职APCs行使抗原提呈的功能。