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背景与目的：
静脉血栓栓塞(Venousthromboembolism，VTE)是由多种致病机理导致的一种血管性疾病，临床表现分为深静脉血栓栓塞(deepvenousthrombosis，DVT)和肺栓塞(pulmonaryembo-lism,PE)。孕产妇因病理生理性改变，使VTE的发病风险增加。DVT尽管不常见，但其并发症：因栓子脱落形成PE易导致猝死，及血栓后综合征严重影响患者生活质量。PE是妊娠期及产褥期孕产妇死亡的一大重要原因，约占欧洲孕产妇死率的50％。随着尸解率的升高，其实际发病率进一步升高。DVT若不及时处理，有24％发生PE，其中约有13％的孕产妇死亡；若给予适当的抗凝治疗，PE发生率可降低至15％，孕产妇死亡率可降低至1％以下。故其早期诊断，早期预防日益受到重视。
VTE是一种多基因遗传病，而国际公认的VTE遗传性危险因子FVL、FIIG20210A等位基因突变不足成为中国人群VTE的危险因素。抗凝血酶-III(antithrombin,AT-III)基因是最早发现的VTE遗传性危险因素。AT-IIl基因SERPINC1(基因库X68793.1，MIM＃107300)位于1q23～25，全长13.9kb，有7个外显子(外显子1、2、3A、3B、4、5和6)和6个内含子。AT-III编码一种由432个氨基酸组成的单链糖蛋白，相对分子质量为58.2ku，该蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一。遗传性AT缺陷症是遗传性VTE的危险因素之一，是一种常染色体显性遗传病。AT-III缺乏在正常人群中约占0.02％～0.17％，在家族性VTE患者中约占4％～7％。AT-III是机体内最重要的抗凝血物质，主要抑制凝血酶的活性，占血浆中全部抗凝活性的70％～80％，在肝素的作用下抗凝活性增强1000～3500倍。AT通过Arg393～ser394的丝氨酸蛋白酶反应点及Lys残基和Arg残基二个功能位点，与肝素、凝血酶结合，发挥其抗凝作用。其它功能主要有：调节蛋白C(PC)受体活性：抑制白细胞活化等抗炎活性；抗肿瘤和抗血管新生作用：抑制中性粒细胞与内皮细胞核因子κB(NF-κB)介导的细胞信号转导：抑制血小板聚集和白细胞黏附，改善微循环等。AT-III基因突变除了与VTE相关外，还与心肌梗死、癫痫、老年痴呆等疾病相关。目前已报道的AT-III基因突变约180余种，其中，国内已发现的AT缺陷类型主要有5种，分别为Exon2上2757C>T，2759C>T，Exon5上9850A>G，Exon6上13328G>A等杂合突变，13389delG引起移码突变。
筛查AT-III基因多态性的常用方法有：限制性内切酶片断长度多态性法，单链构像多态性分析法，等位基因特异的寡核苷酸印记法，毛细管电泳检测法，实时荧光定量PCR分析法，直接测序等。DHPLC是近几年发展起来的一种高通量突变筛查方法，由于其检测效率高、快速、经济的特点，在许多遗传性疾病和肿瘤研究中得到了广泛的应用。而目前国内、外运用DHPLC筛查孕产妇VTE患者AT-III基因多态性方面研究未见报道。
本研究的目的是：根据DHPLC技术平台对孕产妇人群VTE患者AT-III基因多态性进行快速准确的筛查，以发现国内孕产妇VTE患者中AT-III基因突变及常见多态性位点；探索AT-III基因突变及多态性与孕产妇VTE的相关性；为孕产妇VTE患者进行风险评估提供分子遗传学依据。
设计与方法：
1.临床表型检测，AT-III抗原水平(AT-III：Ag)、AT-III血浆活性水平(AT-II:A)检测：AT-III：Ag测定采用ELISA法，AT-III：A检测采用发色底物法。
2.针对AT-III的启动子区，7个外显子及其包括剪接位点的侧翼区设计PCR扩增引物及优化Touch-DownPCR扩增条件。通过DNA测序获得AT-III的各扩增片段野生纯合型基因型标准品.
3.建立检测AT-III基因的PCR-DHPLC技术。将PCR扩增产物与经过测序证实的野生纯合型标准品1:1混合，高温变性后缓慢复性，优化DHPLC分析的条件，运用DHPLC对样品PCR产物在半变性条件下进行分析，通过洗脱峰保留时间峰型和位置的差异区分不同的基因多态性。
4.选取各种不同峰型的代表性标本以及正常对照标本2例，经PCR扩增相应片断后进行双向测序分析。应用DNAstar等软件将测序结果拼接，将待测样本序列与基因库中AT-III的参考序列进行比对，以发现AT-III基因突变及多态性。
5.应用SPSS11.0软件，临床表型生化检验结果进行One-wayANOVA分析。根据DHPLC的分析结果，从各扩增片段中选取一定数量的代表性样品进行测序分析，以证实该方法的准确性；运用RxC表资料的x2检验对各组间基因变异频率的差异进行分析；同时取病例组和对照组AT-III基因多态性无差异的4个SNP位点的基因频率和基因型频率，并应用x2检验确定该群体样本是否符合Hardy-Weinberg平衡。
结果与讨论：
1.通过回顾性研究，我们采用ELISA法及发色底物法分别测定40例孕产妇VTE患者，50例非孕产妇VTE患者及80例正常孕产妇的AT-III抗原和AT-III活性，结果提示：三组AT-III抗原含量水平均稍低于正常水平，不同组间AT-III抗原含量水平相当(F=0.754，P=0.472)。三组间AT-III活性水平比较，差异有统计学意义(F=138.119，P<0.001)。孕产妇VTE组及非孕产妇VTE组，与正常孕产妇组间比较，AT-III活性明显降低(P<0.001)，而孕产妇VTE组及非孕产妇VTE组间AT-III活性差异无统计学意义(P=0.059)。VTE患者因为凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物大量形成，AT-III消耗过多，同时血管内皮细胞的广泛损伤使AT-III合成障碍，造成AT-III活性显著降低，同时极少部分患者因先天性AT-III缺陷症致AT-III的活性下降。
2.运用DHPLC筛查三组AT-III基因型，所有AT-III基因多态性均容易被鉴定，而且未见假阳性峰.在三组170例样本中，发现突变位点3个(2个为已报道的致病突变，1个为新发现的同义突变)；SNP位点7个，其中4个为SNP库已报道的SNP位点，3个为新发现的SNP位点(2个位于内含子Intron3A+11G>A，Intron3A+50G>A，1个位于启动子区-115,G>A)。2种致病突变分别为Exon6G13328A的杂合突变和Intronl5’端+5位点G>A突变。分别因AT蛋白分泌障碍和细胞内降解及产生异常不稳定的mRNA，致AT-III抗凝活性降低，而引起相应的临床表型。仅发生于两VTE组的2个SNP位点(Intron3A+11G>A，Intron3A+50G>A，)及1个同义突变(Exon4+243G>Ac335GTG→GTA(Val))，及有统计学意义的SNP位点Intron4,-53G>A，有可能影响了AT-III基因mRNA表达水平，从而导致VTE的发生。我们检测的血栓组中大多数(约70％)没发现有意义的突变或SNP位点，这些患者的临床表型也可能因表观遗传学(epigenetics)修饰如：DNA甲基化、非编码RNA调控等有关，或者是其它相关基因的缺陷或环境因素所致。
3.x2检验结果显示该所选病例符合Hardy-Weinberg平衡，具有广州地区中国孕产妇人群的代表性。
4.DHPLC具有快速，准确，低成本，自动化的特点，为AT-III基因相关疾病的遗传学咨询、流行病学调查、研究AT-III基因相关疾病的发病风险提供了一种检测方法。
5.AT-III基因突变及多态性对孕产妇VTE的发病存在相关性，2个致病突变之一及1例同义突变发生于孕产妇VTE组。三种有意义的SNP位点在孕产妇VTE组中总的发生率为27.5％，远大于正常孕产妇的2.5％。对于孕产妇进行AT-III易感基因的筛查，及早发现高危孕产妇人群，对其进行早期预防，早期用药，可有效地降低孕产妇VTE的发病率、死亡率及围生儿死亡率。
结论：
孕产妇血栓组，非孕产妇血栓组AT-III活性较正常孕产妇组明显降低，而两血栓组间无明显差异。AT-III基因突变是导致孕产妇VTE的遗传因素之一，功能性SNP位点也可能参与了孕产妇VTE的发生。DHPLC适宜AT-III基因突变及SNP位点的筛查。本研究为孕产妇VTE患者进行风险评估及早期防治提供相应的分子遗传学依据。