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恶性黑素瘤(Malignant melanoma，MM)是一种高度恶性的肿瘤，多见于皮肤，发展迅速，死亡率高。近几十年来，世界范围内的MM的发病率有逐渐升高的趋势。目前MM的临床治疗以外科手术切除为主，对放疗和化疗不敏感，非原位MM则常不能控制其发展。近年来，免疫疗法受到人们的高度重视，部分已经在临床上取得了初步的效果。其在控制MM转移、延缓复发、提高患者生存率方面具有积极作用。免疫疗法主要包括肿瘤疫苗治疗、细胞因子治疗、免疫细胞过继治疗、抗体导向治疗等。 抗体导向治疗始于八十年代后期，利用针对MM相关抗原的单克隆抗体(Monoclone antibody，mAb)携带化疗药物、毒素、放射性核素等进行导向治疗，或交联酶进行前体药物治疗。但目前仍第四军医大学硕d二学位论文处于实验研究阶段，远未达到临床广泛应用的水平。主要原因是目前所知的MM特异性抗原很有限，因此其特异性抗体也较少。寻找高特异性、高亲和力抗MM的抗体一直为研究者所关注。利用噬菌体抗体库技术，可克服杂交瘤技术制备人源性mAb的复杂过程，而且可筛选出多种特异性抗体，因此得到广泛应用。近年来已有不少鼠源性抗MM的mAb或抗体片段用于MM的诊断及免疫治疗，但鼠源性mAb的免疫原性限制了其临床应用，而基因工程抗体克服了鼠源性mAb的主要缺点，显示了良好的应用前景，从而带动了MM导向治疗的发展。 我们在临床工作中发现1例长期存活的MM患者，在从确诊至今的22年期间，肿瘤多次转移至皮肤、肝脏和甲状腺，除肝脏转移灶经手术切除外，其余转移灶目前均已自行消退。本研究旨在构建该患者的噬菌体抗体库，从中筛选抗MM细胞的特异性人抗体，为MM的治疗探索更佳的途径。 我们从该例长期存活的MM患者的外周血中分离PBMC，提取总RNA，并逆转录为cDNA。用PCR扩增多样性、链基因和重链Fd段基因，所扩增的基因均为70。饰左右，分别经撇‘I+方万口I和SPe卜Xhol双酶切后克隆入载体P3MH中，构建K链库和重链库，并取适量电转化后的菌液铺于平皿上计算库容。将K链基因库的质粒经SPol和肋。I双酶切，回收带有多样性轻链基因的载体大片段(约4.Ikb);重链库质粒也以SPol和Xhol双酶切后，回收 0.7kb左右的多样性重链基因片段;用T4 DNA连接酶将回收的两种基因片段连接，组合为Fab段噬菌体抗体库。用两种MM细胞系LIBr和1 585对抗体库进行4轮亲和吸附筛选，挑取第3、4轮单菌落培第四军医大学周盯d卜学位创仑文养表达噬菌体抗体，细胞ELISA法检测抗体的特异性。此外，用ELISA法检测噬菌体抗体与角蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、小鼠IgG、IL一8及转铁蛋白等的反应性。 结果表明，我们所构建的轻链库库容为lxl护，在计算库容的平皿上随机挑取20个菌落，提取的质粒用Sacl+Xbal双酶切后，其中18个菌落提取的质粒得到大小为680bP的片段，则轻链库的重组率为90%。用同样的方法，计算出重链库的库容为3.2、1护，重组率为80%。由轻、重链组合而成的Fab段抗体库的库容为1.2、1护，提取的质粒经saol+筋al和分。I+肠口I，分别双酶切鉴定抗体库的轻链、重链有效重组率为75%。用两种MM细胞系LIBr和1585进行亲和吸附筛选，得到28个克隆，其中4个克隆与两株MM细胞的反应均呈阳性，而与人鳞癌细胞、小鼠CHO细胞及人黑素细胞的反应均呈阴性;22个克隆与LIBr系、2个克隆与1 585系的反应呈阳性，这24个克隆中又有22个克隆与人鳞癌细胞、20个克隆与小鼠CHO细胞的反应亦呈阳性;但所有克隆与人黑素细胞的反应均呈阴性。这28个克隆与角蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、小鼠IgG、IL一8及转铁蛋白等6种无关抗原的反应均呈阴性。 在本研究中，我们采用噬菌体抗体库技术，成功地从1例长期带瘤生存的MM患者体内克隆到特异性抗MM细胞的抗体，为进一步的研究和应用奠定了基础。