论文部分内容阅读
目的:氨氯地平对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)致大鼠骨髓内皮祖细胞损伤的保护作用及其作用机制。方法:实验分为三组,①对照组:加等量含200μmol/L DMSO的全培养液;②oxLDL组(50μg/ml oxLDL)组;③氨氯地平组:50μg/ml oxLDL+0.5μmol/L氨氯地平。贴壁法培养分离与培养内皮祖细胞(EPCs),用细胞免疫荧光、流式细胞术和摄取acLDL和结合UEA-1三种方法联合鉴定EPCs,MTT法检测细胞增殖,transwell测定细胞迁移,明胶粘附法测定EPCs的粘附,photshop7.0计算血管样结构长度,显微镜下观测单个细胞克隆大小和克隆数目,RT-PCR和western blotting分别检测一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA水平和蛋白表达情况,细胞免疫组织化学技术检测eNOS蛋白在EPCs的表达和分布情况,并采用DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧(ROS)的量,采用Griess试剂法测定一氧化氮(NO)水平。结果:①采用贴壁法能从大鼠骨髓的单个核细胞中分离出纯度达70%以上的CD133+/VEGFR-2+双阳性EPCs;②EPCs在第3d时可见集落形成单位(CFUs)出现,第14d时可见铺路石内皮细胞样形态出现;③0.5μmol/L氨氯地平可显著拮抗oxLDL对EPCs增殖的抑制作用;④EPCs经50μg/ml的oxLDL处理后,细胞的迁移能力下降近3倍,而0.5μmol/L氨氯地平可基本恢复EPCs的迁移能力;⑤EPCs经50μg/ml的oxLDL处理后,细胞的克隆形成能力显著下降(7.56±0.85比2.3±0.45,P<0.01,n=5),而0.5μmol/L氨氯地平可部分恢复EPCs的克隆形成能力(5.6±1.54比2.3±0.45,P<0.01,n=5);⑥EPCs经50μg/ml的oxLDL处理后,细胞的粘附能力显著下降(75.02±14.13个/每个视野比29.04±8.21个/每个视野,P<0.01,n=5),而0.5μmol/L氨氯地平可部分恢复EPCs的粘附能力(64.12±15.11个/每个视野比29.04±8.21个/每个视野,P<0.01,n=5);⑦EPCs经50μg/ml的oxLDL处理后,细胞的血管样结构形成能力显著下降(15.13mm±1.62mm/每个视野比1.52 mm±0.71 mm /每个视野,P<0.01,n=5),而0.5μmol/L氨氯地平可显著恢复EPCs的血管样结构形成能力(11.01 mm±2.14 mm /每个视野比1.52 mm±0.71 mm /每个视野,P<0.01,n=5)。机制研究发现:①EPCs经过50μg/ml的oxLDL处理后, eNOS mRNA和蛋白表达均显著下调,一氧化氮(NO)显著减少(24.35±4.62比11.44±1.15),而oxLDL的这种作用可因0.5μmol/L氨氯地平能显著改善,相对于oxLDL处理组,eNOS显著上调(P<0.01,n=3或n=5),NO生成显著增加(18.17.35±1.94比11.44±1.15,P<0.01,n=3);②EPCs经50μg/ml的oxLDL处理后,细胞的活性氧生成显著增加(荧光强度为1.00±0.25比2.53±0.32,P<0.01,n=3),而0.5μmol/L氨氯地平可显著抑制活性氧的生成(荧光强度为2.53±0.32比1.56±0.18,P<0.01,n=3)。结论:氨氯地平能拮抗oxLDL对EPCs的损伤,氨氯地平的拮抗作用与上调eNOS表达和降低活性氧的生成有关。