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近年来,在皮肤创伤研究中的两个难点问题分别是慢性难愈合创面和愈合后的疤痕增生。随着人口老龄化及疾病谱的改变,糖尿病、高血压等各种慢性疾病的发生率增加,导致与之相关的慢性难愈合创面也呈现出高发病率。同时人们对美的认识和追求逐渐提高,减少愈合后的疤痕也成为了人们日益关注的焦点。因此寻找一个既能加快皮肤创伤愈合速度又能减少疤痕提高修复质量的治疗方法已成为本领域的研究热点。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）作为干细胞疗法的理想种子,是一种有效快速并促进伤口无疤愈合的手段,在治疗慢性难愈合创面中显示出极大潜力。但仍存在较大的细胞需量和面临着移植到伤口后快速凋亡导致修复效果减弱等局限性,因此还需寻找新的方式来辅助干细胞疗法。低强度超声（low intensity ultrasound,LIUS）是一种安全、有效的超声,主要依靠机械效应发挥作用。课题组前期研究证实LIUS不仅能够促进BMSCs增殖、分化、迁移,还能减少卵巢颗粒细胞的凋亡。结合文献报道和前期研究,我们认为LIUS可能对包括BMSCs在内的很多细胞都具有促进其抗凋亡的效应,因此设计本研究以验证LIUS对BMSCs的这种效应,并尝试将其用于治疗皮肤创伤。目的本研究旨在证明LIUS能够增强BMSCs的抗凋亡活性,并进一步将其移植到大鼠全层皮肤切除模型中,检测皮肤愈合情况,验证LIUS预处理BMSCs这种方式可以使创伤皮肤快速高质量修复;深入研究并阐明其机制,以期促进干细胞治疗在皮肤领域的广泛应用。方法1.LIUS增强BMSCs抗凋亡活性的研究:（1）倒置显微镜观察BMSCs形态及MTT法检测BMSCs的增殖活性。（2）流式细胞术和PI/DAPI染色检测BMSCs凋亡情况。（3）JC-1染色检测BMSCs的线粒体膜电位变化。（4）DCFH-DA染色检测BMSCs的活性氧（reactive oxygen species,ROS）情况。2.检测LIUS预处理的BMSCs移植后对皮肤创伤的修复效果:（1）建立SD大鼠全层皮肤切除模型,分组进行治疗:包括LIUS组、BMSCs组、LIUS+BMSCs组、LIUS+PC-BMSCs组（超声预处理干细胞组:LIUS+Preconditioning-BMSCs）和Control组,超声参数分别为声强200m W/cm~2和30m W/cm~2,频率0.3MHz,占空比20%,时间20min持续7d。（2）肉眼观察并记录伤口愈合情况,计算各组皮肤创伤愈合率并进行比较。（3）HE染色观察皮肤创伤愈合过程中炎症期、增殖期和重塑期的病理变化。（4）Masson染色观察伤口重塑期的胶原纤维情况。3.研究LIUS预处理的BMSCs移植后促进皮损区愈合的细胞、分子机制:（1）通过TUNEL方法检测组织切片皮损区细胞凋亡。（2）甲苯胺蓝染色观察伤口炎症期肥大细胞情况。（3）采用免疫组化对组织切片进行CD68、CD31、Bax、Bcl-2和Caspase-3特异性染色,分别观察巨噬细胞、内皮细胞和凋亡相关蛋白情况。（4）利用ELISA方法检测血清中细胞因子PDGF、TNF-α和SDF-1的变化。（5）通过q RT-PCR分析皮损区增殖期Bax和Bcl-2相关m RNA表达的变化情况。结果1.LIUS增强BMSCs抗凋亡活性的研究:（1）在30m W/cm~2,0.3MHz,辐照时间20min,连续辐照7d的情况下,MTT结果显示LIUS可以促进BMSCs的增殖活性,显著高于Control组,P＜0.05。（2）LIUS能够减少BMSCs凋亡,包括早期凋亡和晚期凋亡,与Control组比较有统计学意义,P＜0.05。（3）LIUS能够减少BMSCs线粒体膜电位去极化比例,减少了2.61%。（4）LIUS能调节BMSCs内的ROS浓度。2.检测LIUS预处理的BMSCs移植后对皮肤创伤的修复效果:（1）LIUS预处理的BMSCs治疗皮肤创伤愈合速度最快,在第3d和14d与其他组比较有统计学意义,第14d伤口愈合率已经高达91.28±2.69%,P＜0.05。（2）HE染色显示LIUS预处理的BMSCs能够促进伤口炎症期和增殖期的血管增殖;重塑期的毛囊分化程度提高,表皮厚度指数为1.26±0.30,最接近正常皮肤组织。（3）Masson染色显示LIUS预处理的BMSCs增加了伤口重塑期胶原沉积,在28d时胶原容积百分数为90.58±6.64%,高于BMSCs组,P＜0.05。3.研究LIUS预处理的BMSCs移植后促进皮损区愈合的细胞、分子机制:（1）甲苯胺蓝染色表明LIUS预处理的BMSCs移植后能够增加伤口炎症期肥大细胞的数量（10.4±3.0）,与其他组比较有统计学意义,P＜0.05。（2）免疫组化染色结果提示LIUS预处理的BMSCs移植后增加了伤口炎症期和增殖期巨噬细胞的数量（112.6±20.7,100.4±16.4）以及内皮细胞的数量（93.2±11.7,120.4±22.2）。（3）ELISA结果显示LIUS预处理的BMSCs移植后能够促进细胞因子PDGF、TNF-α和SDF-1在炎症期和增殖期的分泌。（4）LIUS预处理的BMSCs移植到伤口后能通过Bcl-2凋亡路径下调皮损区Bax相关m RNA和上调Bcl-2相关m RNA表达,从而减少伤口增殖期细胞凋亡。结论LIUS预处理的BMSCs移植后能够加快皮肤创伤愈合速度,提高修复质量,其机制应该与LIUS增强了BMSCs的抗凋亡活性相关。LIUS有望提升干细胞疗法在皮肤创伤治疗领域的应用潜力,为治疗慢性难愈合创面和疤痕增生等夯实研究基础。