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研究背景随着人们生活节奏的加快及营养过剩,我国冠心病发病逐年上升,而急性心肌梗死依然是冠心病最为凶险的一种类型,及时恢复患者冠脉血流是挽救缺血心肌的最有效的手段,但另一方面在心肌迅速恢复血流的同时会引起一系列血管与心脏的不良后果,如严重的再灌注心律失常、微循环功能紊乱及心肌舒缩功能障碍等,称为心肌缺血再灌注损伤。有报道表示缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)与缺血后处理(Ischemic postconditioning,IPostC)均能减轻心肌缺血再灌注损伤,但是临床上急性心肌梗死是无法预知的,而且一旦发生则非常凶险,所以IPostC更具有价值,而且可操作性更高。传统IPostC,即心肌再灌注前反复多次心肌缺血再灌注,可减少缺血心肌梗死面积,减少再灌注损伤,但会增加额外的靶组织和动脉的损伤。因此,科学家们致力于探索经典心肌保护作用的替代方法,包括远程后处理和在心肌再灌注开始时使用保护性药物。和厚朴酚(hokoniol,HKL),来源于为木兰科落叶乔木植物厚朴的根皮、干皮及枝皮,广泛应用于亚洲药典。许多文献报道,和厚朴酚具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛和神经保护等药理作用。在许多实验模型的报告中,证实HKL对组织缺血再灌注损伤有保护作用,此外,已有报道HKL可以减轻心肌肥厚甚至逆转心肌肥厚所致的心室重构,但HKL后处理对心肌缺血再灌注损伤的作用机制尚不明确。自噬流在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用。研究表明HKL对自噬有调控作用,在改善心肌肥厚报道中,也涉及自噬相关蛋白的变化,还有保护线粒体作用。结合预实验结果,我们提出猜测:和厚朴酚后处理通过促进自噬流与保护线粒体作用减轻心肌缺血再灌注损伤。研究目的1.通过构建C57小鼠心肌缺血再灌注模型,在在体水平明确和厚朴酚在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用;2.通过构建SD大鼠原代心肌细胞缺氧复氧模型,在离体水平明确和厚朴酚在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用;3.探究和厚朴酚在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制及其与自噬流的关系。研究方法在体实验本部分实验采用野生型C57BL/6雄性小鼠(6-8周龄,体重20-25g),通过盲扎法结扎冠状动脉左前降支45min,然后松解结扎线3h来构建心肌缺血再灌注模型。所有入选小鼠随机分成以下5组:假手术组(sham组)、心肌缺血再灌注+溶剂组(I/R组)、心肌缺血再灌注+1 mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和厚朴酚组(I/R+HKL1组、I/R+HKL5组、I/R+HKL10组)。在结扎冠状动脉左前降支30min后,通过腹腔注射一定浓度的药物(生理盐水或和厚朴酚)。在体实验中使用不同的和厚朴酚浓度进行研究。采集各组小鼠的血液样本用于检测小鼠的心肌酶等生化指标,用小动物超声技术检测心脏功能,用TTC-Evans blue双染检测心肌梗死面积,提取各组心脏组织进行蛋白免疫印迹技术检测各组中自噬相关蛋白的表达情况。离体实验本部分实验采用胰酶胶原酶消化法分离提取培养乳鼠原代心肌细胞后随机分为:对照组(Con组)、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧+梯度浓度的和厚朴酚组(5,10,20,40,80μM),利用缺氧盒建立原代心肌细胞缺氧复氧模型,已模拟体内心肌缺血再灌注过程。离体实验中使用不同的和厚朴酚浓度进行研究。用MTS法检测心肌细胞活力,确定和厚朴酚最佳作用浓度为10μM 后,进行后面实验。分组:对照组(Con组)、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧+和厚朴酚组(H/R+HKL组)、缺氧复氧+和厚朴酚+氯喹组(H/R+HKL+CQ组)、缺氧复氧加氯喹组(H/R+CQ组)。用TUNEL染色法分析细胞凋亡水平;用电镜观察心肌细胞超微结构;用JC-1染色后共聚焦显微镜检测细胞线粒体损伤水平;用ROS试剂盒染色后使用共聚焦显微镜检测细胞中活性氧的水平;用GFP-mRFP双标LC3的腺病毒转染细胞后,检测自噬流的水平;提取各组细胞蛋白进行蛋白免疫印迹分析。研究结果1.和厚朴酚后处理减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤2.和厚朴酚后处理减轻原代心肌细胞缺氧复氧损伤3.和厚朴酚后处理对自噬流调节作用4.和厚朴酚后处理改善自噬流作用与ERK1/2信号通路相关结论和厚朴酚后处理通过促进自噬流,减轻线粒体损伤及降低细胞ROS水平,减轻心肌缺血再灌注损伤。