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本论文对这三个酶做了研究,以明确它们在克雷伯杆菌甘油有氧转化生成1,3-丙二醇过程中的作用。
论文主要工作和结论如下：
1.研究了克雷伯杆菌KG1在不同条件下发酵时,其胞内相关酶的酶活变化,并应用单向和二维电泳显示了不同情况下胞内可溶性蛋白的差异。结果表明：有氧条件下,甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶酶活比厌氧发酵低,但有氧条件下甘油脱水酶酶活较高。有氧条件下,在dha操纵子上的酶没有诱导表达时,克雷伯杆菌细胞内也可以测得上述三种酶活。且二维蛋白电泳表明,有氧条件下,生成1,3-丙二醇和没有1,3-丙二醇生成时,其胞内可溶性蛋白在40KD左右存在大量差异蛋白点,这些蛋白点数量超出已知的dha操纵子编码的蛋白数。这表明,有氧条件下克雷伯杆菌甘油代谢生成1,3-丙二醇的过程可能有某些未知蛋白的参与。
2.研究了批式及批式流加发酵中甘油脱氢酶(gdh编码)、甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的过量表达对甘油代谢及1,3-丙二醇生产的影响,结果表明：有氧条件下发酵,甘油脱水酶的过量表达没有提高1,3-丙二醇的产量,相反它对菌体生长和1,3-丙二醇的生产有强烈抑制作用。甘油脱氢酶(gdh)的强化使得甘油脱氢生成的二羟丙酮浓度有所提高,但它对1,3-丙二醇的产量和甘油到1,3-丙二醇的摩尔转化率影响甚微。1,3-丙二醇氧化还原酶的过量表达同样没有提高1,3-丙二醇的产能,但是它降低了副产物的浓度,提高了甘油到1,3-丙二醇的摩尔转化率(从50.6％提高到64.0％);另外它还使有毒中间代谢物3-羟基丙醛的最高浓度降低了约3/4,从而避免了其可能引起的生产停滞现象。
3.首次发现肺炎克雷伯杆菌可以利用停止生长的静息细胞转化甘油生成1,3-丙二醇。研究了甘油脱氢酶(gdh编码)、甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的过量表达对静息细胞转化甘油生成1,3-丙二醇的影响,结果表明：有氧条件下,在排除生长干扰后,甘油脱水酶的过量表达也未能提高1,3-丙二醇的产量,且重组菌中甘油转化和1,3-丙二醇的生成速率都大幅降低。甘油脱氢酶(gdh编码)的过量表达对甘油转化和1,3-丙二醇的生成速率以及甘油到1,3-丙二醇的摩尔转化率影响不大。有氧条件下,1,3-丙二醇氧化还原酶的强化提高了甘油转化速率和1,3-丙二醇的生产强度,转化12 h,重组菌转化液中1,3-丙二醇浓度比野生菌高出20.4％；另外它还提高了甘油到1,3-丙二醇的摩尔转化率。这对1,3-丙二代谢工程育种的研究有重要意义。
4.将dha操纵子上的甘油脱氢酶基因dhaD在克雷伯杆菌KG1中进行了过量表达,重组菌的甘油脱氢酶酶活提高为原始菌的3.9倍。又研究了该酶的过量表达对甘油发酵和甘油的静息细胞转化所产生的影响,结果表明：有氧条件下,酶的强化使得重组菌发酵液和转化液中二羟丙酮的浓度增加了约1倍,而甘油到1,3-丙二醇的摩尔转化率降低了约2/3。另外该酶的过量表达导致菌体生长、甘油转化和1,3-丙二醇的生成速率都大幅降低。
5.肺炎克雷伯杆菌KG1中,分别由gdh和dhaD编码的两种甘油脱氢酶的核酸序列同源性为69％,氨基酸序列同源性为58％。微氧条件下,克雷伯杆菌发酵甘油生成1,3-丙二醇时,dhaD编码的甘油脱氢酶在甘油脱氢过程中起主导作用。在dhaD编码的脱氢酶缺失的情况下,克雷伯杆菌可以利用gdh编码的甘油脱氢酶催化甘油脱氢生成二羟丙酮,并进而代谢生成乳酸、乙酸、乙醇等小分子物质。克雷伯杆菌