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冠心病的死亡人数超过肿瘤及其他疾病,居于全球死因首位。2015年中国冠心病死亡率110/10万,全世界因冠心病死亡的人数有共有5600万。目前针对冠心病的治疗已有很多方法,包括介入术、搭桥术、抗凝溶栓等,但仍然存在一定问题。随着中医药的发展,利用中医药对冠心病进行干预受到了更多的关注,越来越多的证据表明,中医药在协同治疗冠心病方面具有较好的疗效。而这些疗效和证据是否具有更深入的生物学基础,通过挖掘中医药治疗的表观遗传学作用网络,是否可以进一步探寻中医药协同治疗冠心病的作用机制,通过表观遗传关键节点的改变,是否有可能获得冠心病的生物标志物,仍然是值得研究的问题。有鉴于此,我们开展了一系列研究,希望借助现代医学的手段及表观遗传学的研究将中医理论冠心病血瘀证加以客观化有利于冠心病的病证结合治疗,有利于对冠心病血瘀证的作用机制有更深入理解。文献研究PNS干预冠心病的机制研究和系统性评价1 方法针对冠心病的治疗,传统中医药三七表现出巨大潜力,同时因具有抗炎、降脂和抗凝三大作用而广泛应用于心血管疾病的治疗。三七的主要成分,三七总皂苷(Panaxnotoginseng saponins,PNS)的干预在减轻了主动脉内膜病变程度的同时,使其血脂、炎症、血液流变学发生了显著改变,是改善动脉粥样硬化的重要中药。对三七干预冠心病疗效的评价是根据系统评价和Meta分析声明的推荐报告项目进行的。搜索从建库到2017年2月的数据,包括以下数据库:CENTRAL,MEDLINE,EMBASE数据库,WHO ICTRP,中国知网,万方,维普和SinoMed。纳入了所有基于PNS的不稳定型心绞痛符合标准的随机对照试验。参考Cochrane手册,我们评估了每项研究的偏倚风险。用RevMan5.3软件进行荟萃分析。2结果本系统评价总共纳入17项研究共2315例不稳定心绞痛(unstable angina,UA)患者。研究结果表明,PNS在减少主要终点,心电图,包括心绞痛发作频率和持续时间在内的症状改善以及硝酸甘油用量方面具有良好的治疗效果。主要终点事件在口服PNS 加常规用药(PNS plus conventional medicine,PPCM)的 680 例患者中有 21 例(3.0%),而单用传统药物治疗的680例患者(7.8%)中有53例。PPCM对心绞痛发作持续时间(降低1.88min),硝酸甘油用量(降低1.13mg),TC降低0.79mmol/L,TG 降低 0.23mmol/L,LDL 降低 0.77mmol/L),HDL(增加 0.30mmol/L)。与传统药物组相比,口服PNS不良反应少见。然而,由于存在显着的异质性和低质量的研究结果,结果应谨慎对待。三七总皂苷治疗冠心病的系统评价也发现三七总皂苷干预冠心病具有较好的疗效,而三七功善化瘀止痛,选择三七总皂苷干预治疗冠心病血瘀证有较好的前期基础。实验研究实验一受甲基化调控的冠心病血瘀证相关microRNA筛选及验证1方法选择40例研究对象:冠心病不稳定型心绞痛血瘀证组10例、冠心病不稳定型心绞痛非血瘀证组10例,非冠心病血瘀证组10例,正常对照组10例。对所有受试者采集相关个人信息和临床信息。使用高通量测序技术,每组各随机选取5例检测外周血有核细胞中DNA甲基化程度、miRNA和mRNA的表达情况,使用生物信息学方法筛选出冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证与正常对照组的差异基因。以冠心病血瘀证组与正常对照组的差异基因作为主体,进行关联分析,构建DNA甲基化-miRNA-mRNA的基因调控网络。对获得的差异基因进行聚类分析、主成分分析、GO功能富集和KEGG信号通路分析。将每组各10例样本中对基因网络中的关键节点进行qPCR验证。2结果①筛选出UA血瘀证组与正常对照组的差异甲基化位点、miRNA和mRNA,共有28461个甲基化位点有差异(4498个位点甲基化程度下调,23963个位点甲基化程度上调),295个miRNA差异化表达(171个miRNA下调,124个miRNA上调),470个mRNA差异化表达(220个下调,250个上调)。分层聚类分析和主成分分析显示,冠心病血瘀证组、冠心病非血瘀证组和正常对照组之间在DNA甲基化、miRNA和mRNA可将该4组样本区分。②通过对相关基因进行进一步的功能和信号通路分析发现,冠心病血瘀证相关差异表达基因主要与免疫和炎症相关,如免疫反应、I-kappaB激酶/NF-kappaB级联的正调节作用、B细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等还有一部分与信号传导、转录调节相关。③利用UCSC数据库,MiRanda和相关分析获得的基因间相互关系显示,冠心病血瘀证相关DNA甲基化-miRNA-mRNA调控网络中,涉及46个DNA甲基化位点、45个miRNA和109个mRNA。根据网络拓扑分析及数据库比较,确定miR194 promoter-miR194-MAPK信号通路的关键节点。焦磷酸测序和qPCR检测方法发现,关键节点的变化趋势与测序结果基本一致。实验二冠心病血瘀证发生变化时DNA甲基化-miRNA-mRNA调控网络中关键节点的变化1方法收集84例冠心病血瘀证患者,进行随机分为两组(试验组和对照组),两组患者均给予西医常规治疗。试验组在西医常规治疗的基础上加服血塞通胶囊,每次2粒,每天2次;对照组在西医常规治疗的基础上加服血塞通胶囊模拟剂。与西药间隔0.5h后温开水送服,连续服用4周。观察指标以下指标:①心血管不良事件对所有患者治疗后2个月进行电话随访,调查临床重要事件发生率;②心绞痛周发作次数患者入组后每2周随访1次,统计心绞痛周发作次数;③血瘀证积分参考中国中西医结合学会活血化瘀研究专业委员会1986年修订的血瘀证诊断标准;⑤检测相关DNA甲基化位点、microRNA及靶基因;⑥观察用药期间患者的不良反应,并于治疗前后行心电图及肝肾功能检查。每组各随机选取10例患者提取治疗前后外周血有核细胞,通过焦磷酸测序检测DNA甲基化程度,通过qPCR检测miRNA和mRNA的表达情况,观察治疗前后冠心病血瘀证患者的冠心病血瘀证相关miRNA启动子区CpG岛的甲基化水平及miRNA变化及其靶基因和信号通路变化。2结果①血塞通组与对照组基线水平一致,可以进一步比较。在心血管不良事件中,两组并无显著差异。在心绞痛发作次数方面,治疗前后血塞通组与对照组都有显著下降,且血塞通组降低幅度更大。在血瘀证评分项中,治疗前后两组均出现下降趋势,且血塞通组下降趋势更为明显。在血脂的比较中,HDL在血塞通组中治疗前后有显著变化。②冠心病血瘀证发生变化时,miR194 promoter-miR194-MAPK信号通路中的关键节点miR-194 promoter区域甲基化程度,miR-194、FOS、TNFR、MRAS均有改变,与前期生物标志物筛选结果一致。在血塞通组中,miR-194 promoter区域甲基化程度增高,miR-194治疗前后无变化趋势,但在对照组有升高趋势。FOS、TNFR、MRAS mRNA治疗前后均有一定变化趋势,FOS血塞通组有升高趋势。TNFR、MRAS治疗后均有下降,且对照组下降趋势更明显。结论研究发现了冠心病血瘀证中有潜力的关键通路miR194 promoter-miR194-MAPK信号通路。在冠心病血瘀证中,存在DNA甲基化位点、miRNA和mRNA的差异基因表达谱,相关基因功能涉及免疫和炎症反应通路。上述差异基因间存在相互调控关系,可构建冠心病血瘀证相关DNA甲基化-miRNA-mRNA调控网络,并在网络中提取了关键通路miR194 promoter-miR194-MAPK信号通路。通过随机对照试验,进一步确认冠心病血瘀证改善后,miR194 promoter-miR194-MAPK信号通路的关键节点会发生变化。而miR194 promoter-miR1 94-MAPK信号通路的发现很有可能为寻找冠心病血瘀证的物质基础和诊断生物标志物提供新的思路。