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目的：利用卵巢上皮性癌（简称卵巢癌）细胞株SKOV3建立异种移植瘤模型，采用PKH26荧光标记技术结合流式细胞术从移植瘤细胞中分选出处于休眠期的细胞，分析这些细胞的干细胞标记物的表达、体内成瘤能力、体外克隆形成率以及细胞周期分布，探讨PKH高保留的卵巢癌休眠细胞的干细胞属性，为临床卵巢癌的耐药及复发提供理论依据。方法：建立异种移植瘤模型：选用PKH26标记SKOV3细胞（PKH26-labeledSKOV3cells），以4×106细胞浓度接种于20只裸鼠的大腿部皮下，其中5只饲养3周、5只饲养6周后取注射部位的肿瘤组织，胶原酶消化成单细胞悬液，此时细胞命名为SKOV3-P；另外10只接种2周后开始用cDDP（20mg/kg）治疗，间隔6天给药一次，应用5次，治疗结束后3天，取注射部位的肿瘤组织，胶原酶消化成单细胞悬液，此时细胞命名为SKOV3-R。具体的实验方法如下：1荧光显微镜下观察PKH26标记试剂盒荧光标记SKOV3细胞的效率。2用流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析SKOV3-P、SKOV3-R细胞中，三群PKH26不同保留水平细胞群的分布。3采用Real-time-PCR方法分析3种不同PKH26保留水平的SKOV3-P、SKOV3-R细胞中Oct-4和Nestin的mRNA表达水平。4应用流式细胞术检测3种不同PKH26保留水平的SKOV3-P、SKOV3-R细胞中CD44蛋白的表达量。5用平板克隆形成实验检测3组不同PKH26保留水平的SKOV3-P、SKOV3-R细胞体外克隆形成能力。6将3组不同PKH26保留水平的SKOV3-P、SKOV3-R细胞分别接种于裸鼠的大腿皮下，观察各组细胞的体内成瘤能力。73组不同PKH26保留水平的SKOV3-P、SKOV3-R细胞的DNA异倍体细胞周期的分析8统计学方法：数据统计采用SPSS13.0统计软件处理，所有实验重复三次，计量资料以均数±标准差表示（x±s），方差齐性检验，三组以上比较采用方差分析，组间差异采用LSD法，两组数据比较采用t检验，以α=0.05为检验水准，当P＜0.05时，差异有统计学意义；当P＞0.05时，差异无统计学意义。结果：1PKH26标记的SKOV3细胞在荧光显微镜下呈红色，染色效率可达90%以上。满足后续实验要求。2分析饲养3周、6周的SKOV3-P细胞PKH26荧光强度梯度变化，根据荧光保留强度分为高保留组(PKH26hi细胞)、低保留组(PKH26lo细胞)和完全淬灭组(PKH26neg细胞)，3周、6周SKOV3-P细胞中与SKOV3-R细胞中PKH26hi细胞群所占比例分别为：（7.06±0.14）%、（2.65±0.39）%、（6.31±0.38）%。3周、6周PKH26hi细胞数量比较差异有统计学意义（P<0.01），6周SKOV3-P细胞与SKOV3-R细胞中的PKH26hi细胞数量比较差异有统计学意义（P <0.01）。3Real-time PCR显示SKOV3-P与SKOV3-R细胞中PKHhi、PKHlo群均表达OCT4、Nestin，SKOV3-P细胞中PKH26hi群Oct-4、Nestin的表达水平显著高于PKH26lo群（P <0.01），SKOV3-R细胞中PKHhi群的Oct-4、Nestin表达水平显著高于PKH26lo群（P <0.01），SKOV3-R细胞中PKH26hi群Oct-4、Nestin的表达水平明显高于SKOV3-P细胞的PKH26hi群（P<0.05）。4流式细胞术分析显示SKOV3-P与SKOV3-R细胞中PKH26hi群CD44蛋白的表达显著高于PKH26lo群（P <0.01）；SKOV3-R细胞中PKH26hi群CD44蛋白的表达虽高于SKOV3-P细胞中的PKHhi群，但其差异无统计学意义（P>0.05）。5平板克隆形成实验结果显示：SKOV3-P细胞中PKH26hi、PKH26lo、PKH26neg群细胞的克隆形成率分别为（14.67±0.58）%、（11.67±1.53）%、0%，三群细胞克隆形成率比较差异有统计学意义（P <0.01）；SKOV3-R细胞中PKH26hi、PKH26lo、PKH26neg群细胞的克隆形成率分别为（15.33±0.58）%、（12.67±0.57）%、0%，三群克隆形成率比较差异有统计学意义（P <0.01）；SKOV3-P细胞与SKOV3-R细胞中PKH26hi群细胞的克隆形成率比较，后者明显高于前者，差异具有统计学意义（P <0.05）。6体内成瘤能力实验显示：观察接种5000个SKOV3-P-PKH26hi,lo,neg细胞、SKOV3-R-PKH26hi,lo,neg细胞的裸鼠，4周后SKOV3-P-PKH26hi细胞的成瘤率为60%（3/5），SKOV3-R-PKH26hi细胞的成瘤率为80%（4/5）。接种10000个SKOV3-P-PKH26hi,lo,neg、SKOV3-R-PKH26hi,lo,neg细胞的裸鼠，4周后SKOV3-P-PKHhi,lo群成瘤率分别为80%（4/5）、20%（1/5）；SKOV3-R-PKH26hi,lo细胞的成瘤率为100%、20%（1/5）。5000和10000个PKH26neg细胞接种裸鼠4周后，均未成瘤。7流式细胞术分析显示SKOV3-P细胞和SKOV3-R细胞中PKHhi群异倍体细胞大部分处于G0/G1期，两组处于G0/G1期的异倍体细胞数相比，SKOV3-R细胞中PKHhi群异倍体明显多于SKOV3-P细胞中PKHhi群，差异有统计学意义（P=0.02<0.05）。SKOV3-P细胞中PKHlo群异倍体S期细胞数量极少，甚至缺失，而在SKOV3-R细胞中PKHlo群异倍体S期细胞数量明显增多，G0/G1期减少，细胞生长活跃。SKOV3-P细胞与SKOV3-R细胞中PKHlo群细胞中处于S期的异倍体细胞数相比，差异有统计学意义（P=0.01<0.05）。SKOV3-R细胞中PKHlo群细胞处于G0/G1期的异倍体细胞数明显多于SKOV3-P细胞中PKHlo群细胞处于G0/G1期的异倍体细胞，差异有统计学意义（P=0.02<0.05）。结论:1SKOV3-P-PKHhi群及SKOV3-R-PKHhi群细胞均高表达干细胞标记物Oct-4和Nestin、体内成瘤能力强、体外克隆形成率高，但SKOV3-R-PKHhi群细胞有更高的趋势，表明化疗前、后肿瘤中休眠状态的PKH高保留的细胞具有干细胞属性，且化疗后残留的肿瘤干细胞属性更强。提示这种具有干细胞属性的休眠细胞与肿瘤的耐药存在相关性。2SKOV3-P-PKHlo细胞中静止期的异倍体细胞经过化疗的干预可以重新进入细胞周期，形成SKOV3-R-PKHlo细胞中具有增殖潜能的异倍体细胞。提示静止的异倍体细胞与肿瘤的复发存在相关性。