论文部分内容阅读
致病大肠埃希菌引起人类或动物腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血小板减少性紫癜、脑膜炎和败血症等疾病,甚至导致死亡,给公众健康带来严重危害。可移动元件的水平转移在高毒力、强耐药和新型大肠埃希菌形成过程中发挥重要作用。CRISPR/Cas系统,广泛存在于古细菌和细菌中,基于CRISPRs间隔序列的高度多态性,可作为细菌分子分型和进化的靶标;CRISPR/Cas系统参与古生菌和细菌的适应性免疫,可特异性抵抗噬菌体感染及质粒接合转移,从而限制外源遗传物质的水平基因转移。目的1分析不同致病类型大肠埃希菌CRISPR/Cas及其侧翼序列的结构特征,探讨CRISPRs间隔序列能否作为大肠埃希菌分子分型的靶标,评价分型效果。2建立大肠埃希菌CRISPRs的方法,根据CRISPRs型别预测血清型,评价其实际运用和预测血清型效果。3分析产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing E.coli,STEC)的CRISPRs型别与分离时间、地点的关系,探讨CRISPRs型别在STEC菌株感染暴发时的流行病学意义。4探讨CRISPR/Cas与噬菌体、质粒及其介导的可获得毒力和耐药基因的关系,为大肠埃希菌CRISPR/Cas调控耐药和毒力的作用机制提供依据。方法1通过BLAST重复序列识别并获得203株全基因组测序大肠埃希菌CRISPRs,选取前后2000bp作为CRISPRs候选范围;通过CRISPRs finder和BLAST分析CRISPRs的重复序列和间隔序列,使用ClustalX对间隔序列、cas和侧翼序列进行比对,使用SeroTypeFinder和MLST获取菌株的血清型和ST型。2 PCR扩增并测349株大肠埃希菌CRISPRs,CRISPRs finder和BLAST分析大肠埃希菌CRISPRs型别,用血清抗体鉴定菌株血清型。3分析记录GenBank中705株鸟枪法测序STEC菌株的分离时间和地点,使用SeroTypeFinder和CRISPRs finder获取血清型和CRISPRs型别。4利用PHAST获取203株全基因组测序大肠埃希菌噬菌体,通过GenBank获取其质粒信息,通过VirulenceFinder和ResFinder获取染色体和质粒上的可获得的毒力和耐药基因信息。卡方检验分析CRISPR/Cas与质粒和可获得耐药基因的分布;Pearson相关分析CRISPR/Cas与噬菌体和可获得毒力基因的关系。结果1 CRISPR/Cas在大肠埃希菌中的分布全基因测序203株大肠埃希菌中,73.4%含有I-E CRISPR/Cas,其中,1株O177:H21菌株仅有cas2和cas1,菌株1303仅有cas2和cas3,12株完全没有cas;8.4%含有I-F CRISPR/Cas,均含有完整cas;B7A和Co6114菌株同时存在I-E和I-F CRISPR/Cas;17.2%仅有CRISPR3-4(无CRISPR/Cas)。在cas或者CRISPR2中间发现插入序列IS4,IS66和IS30。I-F CRISPR/Cas和无CRISPR/Cas的大肠埃希菌均属于B2种系。2基于CRISPR1上游序列鉴定大肠埃希菌和志贺菌在大肠埃希菌和志贺菌CRISPR1上游侧翼序列有99%一致性,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均大于91%。3建立基于CRISPRs大肠埃希菌分型方法CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3,CRISPR4和CRISPR3-4的间隔序列数目的范围分别是1-25,1-27,4-7,2-22和1-2;独特间隔序列数目分别是339,346,57,66和6,且出现1-72次不等。将I-E CRISPR/Cas,I-F CRISPR/Cas和仅有CRISPR3-4分别命名CT I型,CT II型和CT III型。根据CRISPRs中间隔序列数目、构成和排列顺序进行分型。203株大肠埃希菌被分为79个CT型别(CT I型64个,CT II型9个和CT III型6个);76个血清型和66个ST型。CRISPRs型别能将相同血清(ST)型STEC菌株分成2类,将O157:H7(ST11),O104:H4(ST678)和O26:H11(ST21)分别分成CT I 4和CT I 5,CT I 11和CT I 12,CT I 15和CT I 16。扩增实验室菌株的CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3,CRISPR4和CRISPR3-4,检出率分别是81.1%,94.5%,1.4%,1.4%和4.6%;根据CRISPRs间隔序列分布预测O157:H7准确率是95.0%。4建立CRISPRs STEC菌株的分型方法705株(含13种血清型)STEC菌株中,O157:H7,O26:H11,O111:H8菌株构成比占前三位,分别是44.0%,16.3%,9.8%;时间分布显示STEC菌株于2010年和2011年呈现一个高峰;地区分布显示分离株最多是美国,其次是荷兰,分别占50.9%和7.2%。根据CRISPRs间隔序列可将相同血清型STEC菌株分为不同亚型。O157:H7的A型、O104:H4的B型和O111:H8的A型分别占其菌株的89.0%,87.9%和91.3%;O145:H28的A型和B型分布欧洲,北美主要是C型,D型,E型和G型;O26:H11的H型在欧洲,Z型在美国,而B型和C型在北美和欧洲均有;O69:H11的A型和B型均分离于美国,C型分离于荷兰;O118:H16的C型均来源于美国;O45:H2的A型在北美,B型在中国。5 CRISPR/Cas与噬菌体、质粒和可获得的毒力、耐药基因的关系全基因测序203株大肠埃希菌中,99.5%(202/203)的大肠埃希菌的染色体中含有噬菌体,数目为1-22个;相关分析显示I-E CRISPR/Cas的间隔序列数目与噬菌体数目呈负相关线性关系(r=-0.450,P<0.001)。56.2%(114/203)大肠埃希菌含质粒,含I-E CRISPR/Cas和无CRISPR/Cas的两组细菌的质粒分布有统计学差异(χ~2=6.583,P=0.010)。53株大肠埃希菌含耐药质粒,无CRISPR/Cas和I-E CRISPR/Cas的两组细菌的耐药质粒分布有统计学差异(χ~2=19.756,P<0.001),无CRISPR/Cas和I-F CRISPR/Cas的两组细菌的耐药质粒分布有统计学差异(P=0.017,Fisher’s精确检验)。99.5%的大肠埃希菌的染色体中含有可获得毒力基因,数目为2-28个;相关分析显示I-E CRISPR/Cas间隔序列数目与染色体上可获得毒力基因数目呈负相关线性关系(r=-0.623,P<0.001)。30.01%(61/203)大肠埃希菌的染色体中含有可获得的耐药基因,数目1-21个;含I-E CRISPR/Cas和I-F CRISPR/Cas两组细菌的耐药基因分布有统计学差异(χ~2=9.206,P=0.002)。结论1大肠埃希菌CRISPR/Cas广泛分布,部分菌株存在cas缺失和IS序列。2 CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌。3建立CRISPRs大肠埃希菌分型方法,具有很好的效果。4 CRISPRs对相同血清型STEC菌株分型,在一定的程度上可识别高毒株型别和追溯菌株的分离地区。5 I-E CRISPR/Cas与噬菌体和毒力基因有关;I-F CRISPR/Cas可能能阻止其染色体获得耐药基因;无CRISPR/Cas大肠埃希菌更易存在质粒,且多为耐药质粒。