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稻瘟菌Magnaporthe oryzae无毒基因AvrPiz-t能够被水稻中的抗病基因Piz-t特异性识别,产生免疫反应。为了探究植物R(Resistance,抗病)基因与微生物Avr(Avirulence,无毒)基因相互识别的分子机理,我们采用图位克隆的方法对无毒基因AvrPiz-t进行克隆。AvrPiz-t最终被定位到大约21 kb的区域内,这个区域有6个预测基因。我们通过候选基因的稻瘟菌转化和互补实验,最终克隆到AvrPiz-t基因。AvrPiz-t编码一个108氨基酸的未知功能的预测分泌蛋白,它与稻瘟菌及任何已测序真菌的已知蛋白都不同源。分泌信号肽对于无毒基因的功能是必需的,说明AvrPiz-t在侵染过程中可能进入植物细胞内部,而不被植物细胞表面受体识别。
我们发现在毒性亲本菌株GUY11中同样存在无毒基因AvrPiz-t,不过在其起始密码子上游462 bp处有Pot3转座子插入;在毒性和无毒性的稻瘟菌生理小种中进行序列比较发现,Pot3转座子的插入或单氨基酸置换(A41V)都会导致无毒基因AvrPiz-t功能改变,从而变为毒性。通过对不同启动子长度的AvrPiz-t进行互补实验,我们可以确定大约500 bp以上长度的启动子对于AvrPiz-t的正常行使功能是必需的。
为了探究在稻瘟菌中无毒基因编码的效应因子蛋白的转运信号,我们在稻瘟菌全基因组范围内搜索在500 bp启动子区域以内有转座元件的预测分泌蛋白,得到一共38个这样的分泌蛋白,我们将其定义为SPTATE(the(s)ecreted(p)roteinencoded genes that are(t)ightly(a)ssociated with(t)ransposable(e)lements,SPTATE)。我们在这38个分泌蛋白中发现一个保守的功能域(motif),定义为LXAR。这个motif同时也存在于稻瘟菌的4个已经鉴定的Avr基因中。这个LXAR motif在氨基酸组内是保守的,但在特定的残基处不保守,例如在AvrPiz-t中,LTAR置换为RTAR时,就会导致AvrPiz-t无毒基因失去无毒功能变为毒性。这表明AvrPiz-t中的氨基酸置换(L35R)能够干扰AvrPiz-t与Piz-t的识别,具体作用机制目前未知。
另外,我们发现AvrPiz-t能够抑制在烟草Nicotiana benthamiana中的小鼠BAX蛋白激发的程序性细胞死亡,表明AvrPiz-t与稻瘟菌的致病性有关。
我们克隆到的Piz-t/AvrPiz-t基因对是在水稻/稻瘟菌系统中第二对在分子水平上被鉴定的R/Avr基因对。它对于研究植物与微生物的互作及植物抗病的分子机理有重要意义。另外,根据在不同稻瘟菌生理小种中的序列比对结果,我们推测转座元件的随机插入可能作为无毒基因高度变异性的另一支持。同时,我们提出的LXAR作为稻瘟菌中的一个可能的转运信号,与卵菌中已有报导的RXLR转运信号类似。最后,丝状真菌的效应因子蛋白都具有高度的种系特异性。
落粒性的丧失是水稻驯化过程中的重要事件。由于落粒与产量密切相关,落粒性也是水稻生产中非常重要的性状之一。已有研究克隆到控制水稻落粒性的基因SH4,RT-PCR的结果显示SH4在离层处特异表达(Li et al2006)。而我们构建了SH4p:GUS载体,采用农杆菌介导法转化到水稻日本晴,得到的转基因植株进行GUS染色表达分析。染色结果表明SH4主要在离层和颖壳顶端表达,且随着开花时间的延长其表达量逐渐增强,可能扩散到整个颖壳。
我们通过表型观察得知SH4能够使得颖壳变大,它具体通过使得颖壳厚壁细胞的增多,而使开花期颖壳变大,进而造成使种子变大的表型。
我们发现了两个与SH4直接互作的下游蛋白SHBP5和SHBP6。而SHBP5有一个同源基因AIR9,AIR9在细胞分裂过程中参与细胞板的形成过程。因此SHBP5也很有可能参与到细胞分裂的过程中,推测SH4很有可能是通过与SHBP5的结合参与到细胞分裂过程的。
另外我们将采用in situ(原位杂交),mRNA-Seq(mRNA测序),CHIP-Seq(Chromatin Immunoprecipitation-Sequencing,染色质免疫共沉淀-测序)等实验方法来研究SH4参与细胞生长的分子机理,同时进行颖壳组织成分分析为这一机理提供多方面证据。