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酵母表面展示技术在各种功能蛋白质的展示与应用研究中取得很大的进展,将功能蛋白展示在酵母细胞表面,在抗体筛选、制备和检测中得到了应用。
艾滋病(AIDS,acquired immunodeficiency syndrome)在全球蔓延,艾滋病的检测和预防关乎人类的健康。HIV囊膜蛋白gp41的核心区域为六桶状结构,是相对保守的-段蛋白,将gp41 N端片段(aa 534-678,包括核心区域)展示于酵母细胞表面,不用分离纯化,可直接应用于检测血清中的抗gp41抗体。
研究中将gp41 N端抗原蛋白分别与his标签和flag标签融合表达,并展示到酿酒酵母细胞表面。以pMD18T-gp41重组质粒作为模板,获得目的基因gp41,将基因片段插入到带有标签的载体pICAS-his以及pICAS-flag中,构建gp41酵母表面展示载体。测序结果表明gp41基因正确插入到载体中,与Genebank登录号为U08458(gi：475667)中的gp41序列有96％的同源性,此序列为HIV-1 E亚型。翻译后的蛋白序列与U08458的蛋白序列(AAB04093)比对,有8处不一样,同源性为94％。
酵母表面展示载体携带外源基因整合至酿酒酵母基因组中,分别构建了重组酵母MT8-1/pICAS,MT8-1/pICAS-his,MT8-1/pICAS-flag,MT8-1/pICAS-his-gp41及MT8-1/pICAS-flag-gp41。在葡萄糖诱导下,使抗原蛋白展示表达。为了检测蛋白的表面展示,采用免疫荧光染色的方法进行染色分析。荧光显微镜观察及流式细胞仪检测结果表明His标签以及flag标签均展示在酵母细胞表面；在MT8-1/pICAS-his-gp41表面可以检测到gp41的成功表达,但是MT8-1/piCAS-flag-gp41表面却不能检测到。
选择不同的培养基对重组酵母进行表达优化。当SD-W培养基中葡萄糖浓度为1％,2％时,分别有82.46％和63.64％的细胞表达gp41抗原。以此展示有抗原gp41的酵母建立细胞ELISA检测抗体。在检测溶液中的单克隆抗时,最低检测浓度可达到1ng/mL;应用于多克隆抗体检测,当菌体数量为1OD时,具有较好的检测灵敏度。在艾滋病病人血清样本检测中,样品检测显色结果明显高于阴性对照,且阳性结果分析与抗HIV-1抗体检测试剂盒的抑制性达到95％。为进一步的应用提供了基础。
金黄色葡萄球菌蛋白A与IgG的Fc片段具有高亲和性,已经应用于IgG的分离纯化。基于重组酿酒酵母易于回收和再生等优点,将金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)展示于酵母细胞表面,并成功利用展示有SpA的酵母从兔血清中分离出IgG,这为单克隆抗体的纯化与进一步蛋白质组学研究中高丰度蛋白的去除提供了基础。
本研究将金黄色葡萄球菌蛋白A的基因片段zz插入载体pICAS中,构建了金黄色葡萄球菌蛋白A的酵母表面展示载体pICZZ。经测序后,与Genebank中的序列比对,此基因zz的长度为349bp,翻译后的蛋白ZZ具有116个氨基酸,与Genebank中登录号为CAA65431.1的蛋白同源性达到了100％。zz基因整合至酿酒酵母基因组,重组酵母MT8-1/pICZZ即成功构建。在葡萄糖的诱导蛋白表达后,重组酵母细胞经免疫荧光染色,荧光分光光度计检测结果表明,重组酵母MT8-1/pICZ表面的荧光强度达到65.69,而阴性对照表面的荧光强度仅有13.85。流式细胞仪结果经软件分析得出,80.4％的细胞标记上了荧光,而阴性对照仅仅有3.5％的细胞有微弱的自发荧光产生。
将展示有蛋白A的酿酒酵母与兔血清孵育后,重组酵母在甘氨酸/盐酸缓冲液的作用下,吸附样被洗脱下来。由SDS-PAGE可以看出洗脱样在48kD与62kD之间有一条蛋白带,经western blot、显影后可以看出重组酵母MT8-1/pICZZ吸附的IgG没有杂带；纯度高于兔的IgG标样。重组酵母MT8-1/pICZZ成功地应用于的吸附兔血清中的IgG。